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葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter 1,GLUT1)是葡萄糖转运体家族的一员,在动物糖代谢中发挥着重要的作用。本实验以草鱼和卵形鲳鲹两种不同食性鱼类为研究对象,克隆并分析草鱼和卵形鲳鲹GLUT1基因序列特征,并比较不同糖脂比饲料饲喂和饥饿处理对这两种不同食性鱼类GLUT1基因表达的影响,以及在这不同营养背景下的草鱼和卵形鲳鲹的糖耐受能力和糖代谢差异,为进一步研究鱼类对碳水化合物的利用和调控机制提供研究基础。1、草鱼和卵形鲳鲹GLUT1 cDNA序列和组织表达分析本研究用RACE技术,克隆得到草鱼和卵形鲳鲹GLUT1基因的cDNA全长序列,并对其序列特征及功能进行初步分析。功能结构域分析表明,草鱼和卵形鲳鲹GLUT1均具有12个高度保守的功能结构域,负责葡萄糖的转运,但同时发现在GLUTs家族中具有重要功能的位点如FYYSTS基序在肉食性鱼类GLUT1基因中发生位点改变,这可能影响了GLUT1转运蛋白对葡萄糖的转运效率;荧光定量分析表明,草鱼GLUT1基因在心脏中的表达量最高,其次是大脑;而卵形鲳鲹GLUT1基因在鰓的表达量最高,其次是心脏、大脑和肌肉。2、草鱼和卵形鲳鲹GLUT1基因在投喂不同糖脂比饲料及饥饿处理下的表达模式本研究设计3组不同的糖脂比饲料,分别饲喂草鱼(1.52%、5.84%和34.84%)和卵形鲳鲹(0.63%、2.19%和8.52%)。养殖8周后采样分析草鱼和卵形鲳鲹GLUT1基因在投喂不同糖脂比饲料及饥饿处理(饥饿4周和再投喂4周)下的表达模式,结果发现:不同糖脂比饲料对草鱼肝脏和肌肉GLUT1基因的表达无显著影响(P>0.05),然而饥饿处理显著促进其肝脏和肌肉GLUT1基因的表达(P<0.05);在卵形鲳鲹中,饲喂低糖脂比饲料的卵形鲳鲹肝脏GLUT1基因表达量显著高于其余两组(P<0.05),但在肌肉中,GLUT1基因的表达量随着饲料糖脂比水平的升高而升高。而饥饿处理显著抑制其肝脏和肌肉组织GLUT1基因的表达(P<0.05)。以上结果表明,不同糖脂比饲料和饥饿再投喂对草鱼和卵形鲳鲹GLUT1基因的调节具有种间和组织差异性。3、不同糖脂比营养背景对草鱼和卵形鲳鲹糖耐受能力的影响在投喂不同糖脂比饲料8周后进行糖耐受实验,结果表明,急性高糖负荷下,高糖脂比营养背景草鱼的血糖浓度最先恢复到其正常水平。接着我们进一步探究高糖脂比营养背景有利于提高草鱼糖耐受能力的原因。结果发现,肝脏GLUT1基因表达水平在不同糖脂比处理组中均显著上调(P<0.05),且高糖脂比组的表达水平显著高于其余两组(P<0.05)。此外,高糖脂比营养背景草鱼的肝糖原和肌糖原在各时间点上均显著高于其余两处理组,而低糖脂比处理组显著最低(P<0.05)。相比其它处理组,高糖脂比营养背景草鱼的肝脏GK和PK酶活性显著上升(P<0.05)。以上研究表明,高糖脂比营养背景的草鱼可能通过促进糖原的合成,提高糖酵解关键酶(GK和PK)活性和诱导GLUT1基因的表达来缓解急性高糖负荷,提高其糖耐受力。在急性高糖负荷下,不同糖脂比营养背景卵形鲳鲹的血糖含量随时间均呈现先上升后下降的趋势,且均在注射后3 h时恢复到正常血糖水平,其中高糖脂比组卵形鲳鲹血糖在1-6 h显著高于其余两组,这说明高糖脂比营养背景降低了卵形鲳鲹的糖耐受能力。在急性高糖负荷后,高糖脂比营养背景卵形鲳鲹的糖酵解酶(GK、HK和PK)均呈下降趋势,这可能是过高的糖水平添加使其代谢功能紊乱,而在低水平和适中的糖脂营养背景下,卵形鲳鲹的糖酵解酶活性均被显著提高,这在一定程度上解释了卵形鲳鲹对碳水化合物的利用能力有限的原因。4、饥饿及再投喂对草鱼和卵形鲳鲹糖耐受能力的影响在急性高糖负荷下,饥饿处理有利于提高草鱼的糖耐受能力,其血糖水平在各时间点上显著低于其余两组且在6 h最先恢复到正常水平。接着我们进一步探究饥饿处理有利于提高草鱼糖耐受能力的原因。结果发现,除饥饿再投喂处理组的肝脏组织外,其余各组草鱼肝脏和肌肉组织的GLUT1表达量均呈随时间先上升后下降的趋势,且饥饿处理组肌肉的GLUT1表达量在各个时间点上均显著高于其余两组(P<0.05)。在急性高血糖负荷下,不同处理组草鱼的糖原含量随时间均呈先上升后下降的变化趋势,其中饥饿组的肝糖原含量显著高于其余两组;同时,不同处理组草鱼的肝脏GK酶活性均被诱导,其中以饥饿处理组的增幅最大,而PK酶活性仅在饥饿处理组中呈上升趋势。以上研究结果表明,饥饿处理有利于提高草鱼糖耐受能力,这与其肝脏糖原的合成显著增加、糖酵解酶GK和PK活性被诱导和GLUT1表达量显著上升有关。饥饿处理对卵形鲳鲹糖耐受能力的影响显著,注射葡萄糖后,各处理组卵形鲳鲹的血糖含量随时间均呈现先上升后下降的趋势(1 h均达到峰值),其中以持续投喂组在2 h时最先恢复到其正常水平,这表明持续投喂组的卵形鲳鲹糖耐受能力较强。在卵形鲳鲹肌肉中,除了饥饿处理组GLUT1基因的表达被抑制,其余两组均被显著促进,且持续投喂组的GLUT1表达水平显著最高。此外,在急性高糖负荷下,持续投喂组的卵形鲳鲹糖酵解酶(GK、HK和PK)均有显著上升的趋势。综上所述,不同营养背景对草鱼和卵形鲳鲹的糖耐受能力影响显著,其中高糖脂比饲料投喂显著降低卵形鲳鲹糖耐受能力,但持续投喂显著提高其糖耐受能力,而在草鱼中,高糖脂比营养和饥饿处理背景有利于提高其糖耐受能力。GLUT1基因和糖酵解关键酶(GK、HK和PK)调节的差异成为影响草鱼和卵形鲳鲹在不同糖脂比和饥饿处理下糖耐受能力的重要原因。