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三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]在中国已有近600年的使用历史,除传统的止血和活血化瘀等功效外,三七是防治心脑血管疾病的特效中药材。然而,三七的种植地域局限,生长周期长,需要轮作,导致其产量难以持续提高,市场供需矛盾突出,因此,有必要加强三七相关基础研究,为利用生物技术手段解决资源短缺问题提供支持。三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)是三七的主要活性成分,其生物合成途径已基本明确,可以从基因水平直接调控皂苷的生物合成。三七皂苷合成途径中的法呢基焦磷酸合酶(famesyl pyrophosphate synthase,FPS)催化异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)与二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)缩合形成法呢基焦磷酸(famesyl pyrophosphate,FPP),FPP为倍半萜及三萜皂苷的共同前体,此步酶促反应被普遍认为是皂苷合成途径中的关键限速反应;途径中的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)虽然未直接参与三七皂苷的生物合成,但因其与达玛烯二醇合酶(dammarenedion-Ⅱsynthase,DS)同时以2,3-氧化鲨烯为催化底物,可能导致通向三七皂苷的代谢流减小,也被认为是影响三七皂苷合成的限速酶。本研究构建FPS基因过表达载体,导入已预先转入CAS基因干扰载体的三七细胞基因组内,同时实现对皂苷合成的正向和反向调控,主要研究结果如下:1、利用RT-PCR从三七总RNA中克隆到长度为1200 bp的FPSS序列,与NCBI中公布的三七FPS序列进行比对后发现两者序列相似性为100%。将FPS与pCAMBIA1300S植物表达载体连接,获得pCAMBIA1300S-FPS过表达载体。2、以农杆菌EHA105为媒介将FPS插入到已转CAS干扰片段的三七基因组内,经过5～7轮双抗生素筛选后通过筛选标记基因(nptⅡ和hptⅡ)PCR检测,初步获得7株同时转FPS和CAS干扰片段的阳性细胞系,选取其中5株生长状态较好的细胞系进行后续研究,编号分别为:T-1、T-2、T-3、T-4、T-5。3、利用 RT-PCR 和 qRT-PCR 检测 T-1、T-2、T-3、T-4、T-5 中FPS和CAS的表达水平。结果显示,三七细胞中FPS和CAS基因的普通RT-PCR和qRT-PCR表达分析结果一致,最终筛选获得3株(T-3、T-4、T-5)过表达FPS,且CAS表达抑制的细胞系。4、对未转基因细胞(C)、转CAS基因干扰片段细胞(T-Ri)、T-3、T-4、T-5中总皂苷、重要单体皂苷和植物甾醇含量进行测定。结果显示,T-Ri、T-3、T-4和T-5中的植物甾醇含量均低于未转基因对照(C),说明抑制或干扰CAS基因的表达可使植物甾醇合成支路的代谢流减小,从而使更多前体物质向三七皂苷合成方向流动,促进三七皂苷的积累。此外,T-3、T-4和T-5中的总皂苷含量均高于T-Ri,说明过表达FAS基因有利于打破三七皂苷合成途径中由FPS催化的限速反应,为三七皂苷的生物合成提供充足的前体物质,促进三七皂苷合成。与副产物支路单基因沉默相比,同时进行基因过表达(正向调控)和基因沉默(负向调控)能更有效提高三七皂苷含量,其效果具有叠加效应。