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目的:白血病是一种造血干细胞异常的恶性克隆性疾病,一直以来都是困扰医疗界的一组死亡率极高的疾病,尤其是在儿童和青少年中。目前耐药与治疗后复发成为治疗白血病的一大难题,有研究显示,白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)因其相对静止的状态和较强的DNA修复和抵抗凋亡的能力,成为造成白血病患者治疗失败的主要原因。干细胞更新因子Bmi-1在多种肿瘤中处于高表达状态且对肿瘤的生命活动起到重要的调控作用,是介导白血病干细胞自我更新能力的重要因子。本实验选取白血病K562作为实验对象,从PTEN/AKT信号通路入手,来探究Bmi-1基因调控白血病的增殖与自我更新的新途径。方法:1、本实验选用慢性髓细胞白血病细胞株K562作为研究对象,检测K562细胞株中的Bmi-1基因表达情况。通过本实验室设计构建好的siRNA质粒序列pGenesil-2-Bmi-11和pGenesil-2-Bmi-13,转染K562细胞,降低其中Bmi-1基因的表达,获得两株细胞分别命名为K562-S1和K562-S3,以plasmids pGensil-1荧光序列作为对照转染入K562细胞并命名为K562-CTR,通过western blot及RT-PCR实验检测各组Bmi-1表达。2、降低K562细胞中Bmi-1基因的表达后,通过软琼脂克隆形成实验及裸鼠成瘤实验检测Bmi-1基因对K562细胞自我更新的影响。3、western blot实验检测Bmi-1基因沉默对PTEN/PI3K/AKT通路上相关蛋白表达的影响。4、PI3K抑制剂LY294002降低K562细胞P-AKT的表达后,获得K562-LY细胞,检测该通路上相关蛋白表达的变化,并检测LY294002对K562细胞克隆形成与裸鼠成瘤能力的影响。5、将Bmi-1基因表达降低后的细胞用PTEN抑制剂Bpv处理,检测相关蛋白的表达及克隆形成与裸鼠成瘤能力的变化。6、将收获到的裸鼠肿瘤通过免疫组化实验,分析其Bmi-1和Ki-67的表达情况。结果:1、western blot和RT-PCR实验结果显示Bmi-1基因高表达于白血病细胞K562中,转染si RNA质粒序列pGenesil-2-Bmi-11和pGenesil-2-Bmi-13后K562-S1和K562-S3细胞的Bmi-1基因表达都受到抑制,且pGenesil-2-Bmi-11序列的抑制效果更明显一些,所以选择pGenesil-2-Bmi-11序列做后续实验。2、增殖实验和软琼脂克隆形成实验显示,K562细胞在降低Bmi-1基因的表达后,细胞的增殖和克隆形成能力也降低,同样pGenesil-2-Bmi-11序列的抑制效果更明显一些,所以我们选择K562-S1组细胞做后续试验,通过裸鼠成瘤实验证实,K562-S1组的裸鼠成瘤能力较K562组降低。3、western blot结果显示,Bmi-1基因表达的降低,抑制了P-AKT的表达,PTEN的表达反而增高。说明Bmi-1的改变可以影响PTEN/PI3K/AKT通路上相关蛋白的表达。4、PI3K抑制剂处理后的K562-LY细胞,P-AKT表达降低,克隆形成和裸鼠成瘤能力也明显下降。5、选择合适的PTEN抑制剂浓度处理K562-S1细胞后,细胞PTEN的表达降低,却激活了P-AKT的活性,同时K562-S1-B3组细胞的克隆形成和裸鼠成瘤能力相比较于K562-S1细胞有所增高。6、免疫组化结果显示,裸鼠成瘤后的肿瘤组织中,Bmi-1基因的沉默使得肿瘤组织中Bmi-1与Ki-67表达均下降,Bmi-1与Ki-67蛋白的表达量与肿瘤的大小以及成瘤率呈正比,Ki-67表达量与Bmi-1基因表达量呈正比。结论:Bmi-1基因的表达与白血病K562细胞的克隆形成及裸鼠成瘤能力呈正相关,PI3K/AKT信号通路可能是介导这一调控的机制之一。