【摘 要】
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【目的】化疗耐药是晚期前列腺癌临床治疗的一个棘手问题,并且相关机制仍未完全阐明。新近研究表明,肿瘤微环境特别是其中的癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAF）对肿瘤进展及化疗耐药形成具有重要作用。本研究以肿瘤微环境中癌相关成纤维细胞为切入点,结合外泌体作为细胞间通讯介质作用,研究晚期前列腺癌多西他赛化疗耐药问题,并探索其中潜在机制。【方法】本研究首先应用
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【目的】化疗耐药是晚期前列腺癌临床治疗的一个棘手问题,并且相关机制仍未完全阐明。新近研究表明,肿瘤微环境特别是其中的癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAF）对肿瘤进展及化疗耐药形成具有重要作用。本研究以肿瘤微环境中癌相关成纤维细胞为切入点,结合外泌体作为细胞间通讯介质作用,研究晚期前列腺癌多西他赛化疗耐药问题,并探索其中潜在机制。【方法】本研究首先应用含梯度浓度（0-80n M）多西他赛的培养基培养PC3细胞72h,CCK8法检测细胞活力,绘制药物浓度-肿瘤细胞增殖抑制曲线,计算多西他赛作用于PC3细胞的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）,以确定下一步实验中处理PC3细胞的多西他赛浓度。接着,从手术切除的新鲜前列腺癌标本中分离纯化CAF,从CAF培养上清液中提纯CAF-exo,并行鉴定和示踪实验。实验分4组:CON组（常规培养基处理组）、CAF-medium组（CAF条件培养基处理组）、CAF-exo组（含50ug/ml CAF-exo的常规培养基处理组）、Exo-F-medium组（无外泌体CAF条件培养基处理组）。PC3细胞经上述4种培养基孵育24小时后,用含10n M多西他赛培养基继续培养72小时,然后应用CCK8法检测细胞活力,评估CAF-exo对PC3细胞多西他赛耐药性的影响,并应用Western blotting和q RT-PCR检测各组PC3细胞USP8和CX43表达情况。进一步,应用高表达USP8慢病毒感染PC3细胞（LV-USP8-PC3细胞）上调USP8及CX43表达（USP8/CX43轴）,评估其对PC3细胞多西他赛耐药性的影响,并测定多西他赛作用于LV-USP8-PC3细胞的IC50。最后,体外实验验证USP8过表达对PC3细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。【结果】多西他赛作用于PC3细胞的IC50为8.5±0.36n M。从新鲜组织中成功分离纯化了CAF,且相比PC3细胞,CAF对多西他赛具有较高的耐受性。实验证实CAF-exo能够被PC3细胞摄取。分组实验结果显示,CAF-medium组PC3细胞活力高于CON组（P<0.01）,Exo-F-medium组PC3细胞活力低于CAF-medium组（P<0.01）,而CAF-exo组PC3细胞活力显著高于Exo-F-medium组（P0.05）。多西他赛作用于CAF-exo-PC3细胞IC50为10.9±0.59n M。Western blotting结果表明,CAF-medium组和CAF-exo组PC3细胞USP8蛋白、CX43蛋白表达量低于CON组（P<0.01）,Exo-F-medium组PC3细胞USP8蛋白、CX43蛋白表达量高于CAF-medium组和CAF-exo组（P<0.01）。q RT-PCR结果表明,CAF-medium组和CAF-exo组PC3细胞USP8 m RNA表达量低于CON组（P<0.001）,Exo-F-medium组PC3细胞USP8 m RNA表达量高于CAF-medium组和CAF-exo组（P0.05）。通过慢病毒感染、筛选,成功建立稳定高表达USP8和CX43蛋白的细胞系LV-USP8-PC3。应用q RT-PCR和Western blotting进行效能验证,结果显示:LV-USP8-PC3细胞USP8 m RNA表达量为对照组10.0倍（P<0.001）,USP8蛋白表达量为对照组的3.4倍（P0.05）,CX43蛋白表达水平为对照组1.4倍（P<0.05）。实验结果显示:LV-NC+CAF-exo组PC3细胞活力高于LV-NC+CON组（P<0.001）,而LV-USP8+CAF-exo组PC3细胞活力低于LV-NC+CAF-exo组（P0.05）。这些结果表明,上调USP8/CX43轴能够回复CAF-exo增强PC3细胞对多西他赛耐药性的作用。多西他赛作用于LV-USP8-PC3细胞IC50为7.0±0.39n M。最后,体外实验证实,相比LV-NC-PC3细胞,LV-USP8-PC3细胞增殖、迁移、侵袭能力减弱。【结论】（1）CAF-exo可增强PC3细胞对多西他赛的耐受性;（2）CAF-exo是通过下调USP8/CX43轴增强PC3细胞对多西他赛耐药性的。
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