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实验目的：肝细胞肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其术后高复发率是制约肝癌治疗效果的首要因素。其中在循环系统中耐失巢凋亡的肝癌循环肿瘤细胞在肝癌的复发转移中起到了重要作用。肿瘤细胞脱落入血已被证实发生于肿瘤形成的早期,然而,并非所有进入循环的肿瘤细胞都会形成转移灶,这取决于耐失巢凋亡肿瘤细胞的生物学特性、定植器官的微环境及机体的免疫状态等因素。本研究的目的就是观察耐失巢凋亡肝癌细胞的肿瘤自我种植现象,以及肿瘤来源的外泌体在肝癌细胞自我种植中的作用及内在机制。材料与方法：本研究通过polyHEMA包被的低粘附培养板对正常肝癌细胞系HuH-7和HCCLM3进行长时间连续悬浮培养后获得耐失巢凋亡的肝癌细胞株,通过细胞增殖实验,流式细胞术检测凋亡、Transwell实验等方法,观察耐失巢凋亡肝癌细胞株细胞株的增殖能力、抗凋亡能力、侵袭转移能力等生物学特性的变化。通过构建裸鼠肝癌原位荷瘤模型,观察耐失巢凋亡的肝癌细胞在体内的肿瘤自我种植现象。在体外通过提取不同组织来源细胞的分泌物及分泌物不同成分检测其对耐失巢凋亡肝癌细胞穿内皮细胞侵袭转移能力的影响。在机制上,利用microRNA芯片技术对不同细胞来源外泌体中microRNA表达检测进行检测,同时对外泌体共培养后耐失巢凋亡肝癌mRNA的表达谱进行检测,结合两者结果预测外泌体中mircoRNA对耐失巢凋亡肝癌细胞穿内皮细胞侵袭转移能力的调节,并进一步通过microRNA干扰技术在相应的耐失巢凋亡肝癌细胞中进行验证。结果：实验结果发现(1)肝癌细胞系HuH-7和HCCLM3随着失巢培养时间的递增逐渐聚集成团。(2)耐失巢凋亡肝癌细胞的迁移能力明显增强而侵袭能力无明显变化,在失巢环境中再次分散成单细胞时耐失巢凋亡细胞株具有较快聚集成团能力,且抗失巢凋亡能力显著增强。耐失巢凋亡肝癌细胞恢复贴壁培养后细胞增殖能力无明显变化。(3)耐失巢凋亡肝癌细胞通过静脉注射进入肝癌原位荷瘤裸鼠的体内28d后可以观察到肿瘤自我种植现象。(4)肿瘤细胞来源的分泌物能明显增强耐失巢凋亡肝癌细胞的穿内皮细胞转移侵袭能力。(5)肿瘤细胞来源的分泌物中外泌体能显著增强耐失巢凋亡肝癌细胞的穿内皮细胞转移侵袭能力,而细胞因子等其他分泌物作用不明显。(6)外泌体对耐失巢凋亡细胞的调节作用是通过细胞胞吞作用实现的。(7)不同细胞来源外泌体的microRNA芯片检测共筛选出20条在HuH-7细胞外泌体中高表达的与细胞侵袭转移能力相关的microRNA。(8)外泌体共培养后耐失巢凋亡肝癌mRNA的表达谱进行检测共筛选出17个表达下调的基因。(9)肿瘤来源的外泌体中含有的miR-25-5p在调节耐失巢凋亡肝癌细胞穿内皮细胞迁移侵袭能力方面起到了重要作用。(10)外泌体与耐失巢凋亡肝癌共培养后LRRC7表达下降,应用miR-25-5p抑制剂后LRRC7表达上调。结论：综上所述,我们通过细胞失巢培养模型,建立了耐失巢凋亡肝癌细胞株。这一细胞亚株在生物学行为方面与来源的肝癌细胞系相比发生了一定的变化。该类细胞在失巢环境中细胞间相互聚集成团生长,细胞的迁移能力获得明显的增长。当在失巢环境中再次分散成单细胞时耐失巢凋亡细胞株具有较快聚集成团的能力,且抗失巢凋亡能力显著增强。更为重要是的该类细胞在体内裸鼠荷瘤模型中被发现具有肿瘤自我种植现象,并在体外证实了该现象是由肿瘤来源的外泌体对耐失巢凋亡细胞转移侵袭能力的调节介导的。机制上,耐失巢凋亡肝癌细胞胞吞了miR-25-5p高表达的肿瘤来源外泌体,导致自身LRRC7表达下调进而增强了细胞转移侵袭能力。