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目的:糖尿病足发病率逐年增高,已成为非创伤性截肢的主要原因。其主要发病原因是下肢供血障碍,且主要为流出道闭塞,即越远端闭塞越重,故搭桥、介入均难再通。近年来随着干细胞研究的进展以及分离、纯化干细胞方法的不断改进,使采用干细胞治疗等治疗性血管生成方法在缺血部位重建有效的侧支循环成为可能,并通过动物实验验证了将骨髓单个核细胞植入梗死部位后可促进局部的血管生成。2002年Tateishi-Yuyama等在国际首次报道了应用骨髓造血干细胞移植治疗周围血管病患者的临床报告,接受自体骨髓单个核细胞移植治疗的43例下肢动脉缺血性疾病患者均获得了满意的疗效。2003年后国内外应用干细胞分离仪采集动员后的外周血干细胞移植获得成功。2006年张楠等报道了骨髓动员在糖尿病小鼠缺血肢体新生血管形成中的作用,2007年有学者报道了内皮祖细胞与单个核细胞移植对糖尿病大鼠血管病变疗效的比较,但对骨髓动员与单个核细胞移植治疗疗效的比较尚未见报道。毛细血管密度改变是判断干细胞移植术疗效的直观证据和客观指标,为临床提供依据。本研究旨在:1通过动物实验复制动物(SD大鼠)糖尿病模型及后肢缺血模型,通过毛细血管密度的改变比较骨髓动员与单个核细胞移植治疗的疗效。2观察单个核细胞移植前后毛细血管密度改变,进一步判断其疗效,为临床提供依据。3通过内皮动能的监测,观察骨髓动员与单个核细胞移植治疗对糖尿病大鼠全身血管病变的影响。方法:实验对象SD大鼠36只,雄性,8周龄,体重180-250克之间,制备糖尿病大鼠后肢缺血模型,随机选取30只大鼠进行骨髓动员,其中15只进行骨髓动员(B组),15只于动员后行单个核细胞移植(A组),其余6只为空白对照组(C组),制做双后肢缺血模型,不进行骨髓动员及单个核细胞移植。骨髓动员前及动员后3天(移植前)、移植后第2、4周于内眦静脉取血检测ET水平,单个核细胞移植后4周取双后肢肌肉做病理检查,检测毛细血管密度并进行A组与B组治疗效果比较。1糖尿病大鼠模型的制备大鼠禁食12小时后,按65mg/kg剂量一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)1.5-2ml,给药72小时后连续两次通过尾静脉采血,检测空腹血糖>16.65mmol/L作为糖尿病大鼠模型。2糖尿病大鼠后肢血管病变模型的制备麻醉大鼠后,取其双侧腹股沟韧带至膝关节上下各行一纵行缺口,分离、结扎、离断股动脉及其分支。观察3天,手术后肢逐渐萎缩,活动力下降,无坏疽,为糖尿病大鼠后肢血管病变模型的制备成功。3骨髓动员和动员后单个核细胞的分离及移植糖尿病后肢缺血模型制备成功后,A组及B组皮下注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF,150ug.kg-1.d-1),同时C组每天皮下注射生理盐水1ml/d,连续3天。A组用10%水合氯醛麻醉后,心脏直接采血5ml,用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,调整细胞浓度至5×108/ml,以1ml注射器自结扎部位以下每0.5cm注射0.1ml, B组及C组同法等量采血后注射等量PBS(磷酸盐缓冲溶液),继续饲养大鼠4周。4外周血WBC和CD34+细胞计数动脉离断术后当天随机从A、B、C三组大鼠各选5只大鼠内眦静脉取血0.5ml,同法骨髓动员3天后以上大鼠各取血0.5ml,采用Ficoll液离心制备外周血单个核细胞, FITC- CD34+单抗标记后用流式细胞计数仪检测WBC和CD34+细胞。5血管内皮功能生化指标的测定血浆内皮素(ET)采用放射免疫分析法测定,单位:pg/ml。6注射部位肌肉中毛细血管密度的测定常规方法制备大鼠肌肉光镜组织切片,行苏木素-伊红(HE)染色,免疫组织化学法行vWF染色进行毛细血管密度的测定。7统计学处理所有数据用SPSS13.0软件处理,计量资料以均数±标准差表示,组间差异用两样本均数的t检验进行比较,实验前后用配对资料t检验进行比较,两组以上比较采用单因素方差分析。显著性用P值表示,P<0.05为差异有显著性,P<0.01为差异有极显著性。结果:1实验动物观察双侧股动脉离断后3天大鼠缺血后肢逐渐萎缩,活动力下降,所有动物在处死取材时局部均无明显坏疽。2流式细胞仪检测WBC和CD34+细胞结果显示:A组动脉离断术后当天WBC和CD34+细胞分别为(7.37±1.36)×109/L和(0.15±0.04)%,动员3天后WBC和CD34+细胞分别为(22.53±2.44)×109/L和(2.27±0.38)%,明显高于动员前(P<0.05), B组动脉离断术后当天WBC和CD34+细胞分别为(7.83±1.15)×109/L和(0.15±0.05)%,动员3天后WBC和CD34+细胞分别为(23.09±2.44)×109/L和(2.29±0.36)%,明显高于动员前(P<0.05),说明肢体缺血和G-CSF动员能明显提高外周血WBC和CD34+细胞含量。C组动脉离断术后当天WBC和CD34+细胞分别为(7.38±1.15)×109/L和(0.16±0.05)%,未行动员3天后WBC和CD34+细胞为(9.82±1.40)×109/L和(0.45±0.10)%,CD34+细胞比例明显增高(P<0.05),说明肢体缺血能明显提高外周血CD34+细胞含量。A、B两组外周血WBC数和CD34+细胞含量均明显高于C组(P<0.01),但A、B两组比较无统计学差异(P>0.05)。3血浆ET的测定A组、B组及C组动员前ET水平差异无统计学意义(P>0.05),移植前(动员后3天),移植后2周,移植后4周ET水平均低于C组,差异有统计学意义(P<0.05),A组和B组各期ET水平比较无统计学意义(P>0.05)。4毛细血管密度的测定A组和B组vWF染色阳性的毛细血管密度分别为5.8±1.9个/HP、4.9±1.6个/HP,均高于C组3.7±1.8个/HP,差异有统计学意义(P<0.05),A组毛细血管密度高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)结论:1骨髓动员和动员后单个核细胞移植均可促进缺血后肢毛细血管的生成,本研究发现动员后单个核细胞移植效果优于单纯骨髓动员。2通过流式细胞仪检测CD34+细胞发现骨髓动员能明显提高外周血CD34+细胞含量,促进后肢毛细血管的生成。3通过ET水平的变化发现骨髓动员和动员后单个核细胞移植均可改善糖尿病大鼠的内皮功能,但两种方法的改善效果无差异。