目的:本实验通过原代培养大鼠海马神经元,复制改良Scott’s神经细胞液压冲击损伤模型,采用RT-PCR技术,从mRNA水平研究PAFR、COX-2和GluR2损伤后的时序性变化;采用免疫荧光细胞化学技术,利用激光共聚焦显微镜观察PAFR、COX-2和GluR2在海马神经元的定位,探讨它们之间的相互关系以及参与脑损伤的机理。方法:采用清洁级新生SD大鼠(出生后24h之内),分离海马神经元,进行体外原代培养。采用免疫荧光双标进行神经元鉴定,选择神经元纯度高,生长状态良好细胞随机分为对照组及损伤后4h组、8h组、12h组、24h组、48h组。复制改良Scott’s中度液压冲击神经元损伤模型,采用H.E染色、透射电镜技术研究中度液压冲击损伤对神经元细胞形态及超微结构的影响;应用RT-PCR技术对PAFR、COX-2和GluR2的表达进行定量研究。采用免疫荧光双标技术研究PAFR、COX-2和GluR2在海马神经元中的定位,进一步探讨可能参与的脑损伤机制。结果:1大鼠海马神经元的原代培养和形态学观察:海马神经元在培养第七天分化成熟,相差显微镜下可见神经元胞体丰满,折光性强,胞核位于细胞中央或偏于一侧,胞核及核仁清晰可见,神经元突起粗大并相互交织成网。2神经元鉴定:用神经元及星型胶质细胞特异性蛋白MAP2和GFAP对培养细胞进行免疫荧光双标,MAP2呈红色荧光,GFAP呈绿色荧光,神经元阳性细胞计数结果显示:神经元纯度达70-80%。3 H.E染色结果:中度液压冲击损伤后神经元数量减少,损伤的神经元形态学变化显著,突起明显变短,胞浆红染加深,胞核缩小。4透射电镜观察结果:中度液压冲击损伤后神经元胞质水肿,细胞器数量显著减少,胞质内有很多大小不等的圆形、椭圆形空泡,线粒体嵴部分或全部融合消失,部分线粒体成髓样化或空泡化,粗面内质网扩张成池状,脱颗粒现象明显,游离的核糖体数量减少,部分双层核膜融合或消失。损伤后4h、12h、24h各组比较,12h组损伤最重,4h次之,24h最轻。5 RT-PCR结果:(1) COX-2:对照组COX-2呈低表达,损伤后表达逐渐增高,12h达最高值,随后逐渐下降,损伤后12h组与对照组相比差别有显著性(p<0.05)。(2) GluR2:对照组GluR2呈高表达,损伤后表达逐渐减弱,8h达最低值,而后逐渐回升,损伤后8h、12h组与对照组相比差别有显著性(p<0.05)。(3) PAFR:对照组PAFR呈高表达,损伤后表达逐渐减弱,8h达最低值,而后逐渐回升,损伤后8h、12h组与对照组相比差别有显著性(p<0.05)。6免疫荧光细胞化学染色结果:(1) COX-2免疫荧光细胞化学染色结果:MAP2标记的海马神经元呈红色荧光,COX-2免疫荧光阳性细胞呈绿色荧光,两者共定位显示黄色荧光。COX-2在神经元细胞膜、胞浆、轴突及树突均有表达。(2) GluR2免疫荧光细胞化学染色结果:MAP2标记的海马神经元呈红色荧光,GluR2免疫荧光阳性细胞呈绿色荧光,两者共定位显示黄色荧光。GluR2在神经元表达以轴突、树突及胞浆内轴突的起始部为主,细胞膜有一定表达。(3) PAFR免疫荧光细胞化学染色结果:MAP2标记的海马神经元呈红色荧光,PAFR免疫荧光阳性细胞呈绿色荧光,两者共定位显示黄色荧光。PAFR在神经元的细胞膜表达最多,其次为轴突、树突,胞浆仅有少量表达。结论:1正常时COX-2在体外培养神经元中仅有少量表达,主要定位于细胞膜、胞浆、轴突及树突。损伤后4h表达增加,12h达最高值,48h时仍高于正常。2正常时GluR2在体外培养神经元有较多表达,主要定位于轴突、树突及胞浆内轴突的起始部及细胞膜。损伤后4h表达下降,8h达最低值,48h时仍低于正常。3正常时PAFR在体外培养神经元中有较多表达,主要定位于细胞膜,其次为轴突、树突,胞浆仅有少量表达。损伤后4h表达下降,8h达最低,48h时仍低于正常。4 PAFR、COX-2和GluR2在体外海马神经元中度液压冲击损伤中表达的时序性变化特点基本一致,在神经元定位表达比较一致,三者关系密切,共同参与脑损伤病理生理过程。