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酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和酒酒球菌(Oenococcus oeni)是重要的两类葡萄酒工业微生物,其分别能够进行酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵,为了获得酒精发酵与苹果酸-乳酸发酵同时进行的新型工程菌株,本研究基于前人对酿酒酵母1450和酒酒球菌SD-2a原生质体跨界融合的研究,对两亲株原生质体制备与再生、融合方法及条件进行研究,并尝试采用灭活单、双亲原生质体技术并结合电诱导融合法进行不同灭活原生质体的融合探索,以进一步对其融合的可行性和重复性作验证性探讨,为获得具有高效降酸且遗传性更加稳定的融合子提供理论与试验依据。主要研究内容和结论如下:1.对实验室保存的酿酒酵母1450与酒酒球菌SD-2a两亲本进行抗药性的筛选,确定完全抑制酵母1450和酒酒球菌SD-2a生长的抗生素浓度分别为100μg/mL的放线菌酮和20μg/mL的氨苄青霉素。2.通过单因素和正交试验,分别确定亲本酵母1450和酒酒球菌SD-2a原生质体制备与再生的最佳条件。酿酒酵母1450原生质体制备的最佳条件为:菌龄6 h,预处理剂3%β-巯基乙醇,蜗牛酶浓度1.5%,酶解温度42℃,酶解渗透压稳定剂0.5 mol/L蔗糖。在此条件下,酵母1450原生质体形成率与再生率可达14.14%。酒酒球菌SD-2a原生质体制备的最佳条件为:菌龄34 h,预处理剂青霉素G钠0.3μg/mL,溶菌酶浓度1 mg/mL,酶解温度37℃、酶解渗透压稳定剂0.8 mol/L KCl。在此条件下,酒酒球菌SD-2a原生质体形成率与再生率达10.65%。3.本试验初次对两亲本原生质体进行紫外与热灭活条件的研究,确定了两亲本原生质体的灭活条件:在20W紫外灯10 cm处的照射条件下,酵母1450和酒酒球菌SD-2a原生质体的灭活时间分别以180 s和100 s为最佳;在水浴55℃的条件下,1450和SD-2a原生质体热灭活时间分别为15 min和9 min。4.对酵母1450和酒酒球菌SD-2a原生质体进行化学PEG融合,采用不同融合温度和不同PEG融合浓度条件对两亲本原生质体融合的研究,最终确定在浓度30%PEG-4000,融合温度32℃的条件下,两亲本融合率效果最好。5.初次对两亲本原生质体采用热灭活方法进行不同灭活原生质体电诱导融合,确定以两亲本活体和SD-2a单灭活方法处理后,在电压30V,脉冲时间30us,脉冲数5次,脉冲间隙600 ms的融合条件下,融合效果较为理想。