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结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种慢性、消耗性人兽共患传染病，可通过患者咳嗽或打喷嚏时形成的带菌气溶胶，在人与人、人与动物之间传播。据报道，结核病是全球范围内危害人类健康的十大重要传染病之一，每年约有一千万人感染结核病，造成约一百七十万人死亡。近些年来，由于多重耐药结核分枝杆菌（MDR-TB）及广谱耐药结核分枝杆菌（XDR-TB）的流行及其与HIV病毒的混合感染，使得结核病的防控变得更加困难。因此，迫切需要阐明结核病的发病机制，寻找结核病新的药物作用靶点，创制新型疫苗以降低该病给人类健康造成的危害。
众所周知，肺泡巨噬细胞是MTB主要感染及入侵的靶细胞，在MTB感染细胞的过程中，许多毒力因子都发挥了重要的作用。而丝氨酸蛋白酶类是MTB的一类重要的毒力因子，与菌体对巨噬细胞的侵袭以及在巨噬细胞中的持留密切相关，但该酶类的理化特性及其在致病性方面所扮演的具体作用仍有待进一步研究。
本研究利用生物信息学方法，分析了Rv3194c蛋白可能为MTB的一个潜在的胞外丝氨酸蛋白酶，在大肠杆菌中表达并纯化了结核分枝杆菌Rv3194c蛋白，实验证实了Rv3194c蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性：体外可以降解牛血清白蛋白（BSA）、牛乳（Milk）、酪蛋白（Casein）及明胶（Gelatin），同时在485nm激发波长和535nm吸收波长的条件下能够检测到Rv3194c降解荧光标记的酪蛋白（FITC-Casein）所发出的荧光。进一步的实验表明，Rv3194c蛋白发挥丝氨酸蛋白酶活性所需的最佳温度为40℃、最适pH值为8.0，同时二价金属离子Mn2+离子和Ca2+离子可以促进其酶活性的发挥。体外抑制剂筛选结果表明，中药单体-桦木酸及化学抑制剂-PMSF和Roche inhibitor cocktail能够有效抑制Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性。定点突变研究结果显示，突变S253、G254、S86、G87、D308和S309位点可以降低Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性，特别是D308和S309位点对Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性起着关键性的作用，可降低Rv3194c蛋白酶70%的酶活性。
将rv3194c基因及其突变体rv3194cM（D308A和S309A）基因连接到pMV261-AI-N穿梭载体构建重组质粒pMV261-rv3194c及pMV261-rv3194cM，测序鉴定成功后将重组质粒与空载体质粒分别电击转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Ms）中，构建重组耻垢分枝杆菌Ms-261-Rv3194c、突变体菌株Ms-261-Rv3194cM及含有空载体的重组耻垢分枝杆菌Ms-261。亚细胞定位分析，结果表明在重组耻垢分枝杆菌及BCG中Rv3194c蛋白均能够在菌体组分全菌体、胞壁、胞浆、胞膜中被检测到，同时Rv3194c蛋白能够在重组耻垢分枝杆菌的培养滤液中被检测到，表明Rv3194c可能为结核分枝杆菌的一个潜在的胞外丝氨酸蛋白酶。同时体外测定Ms-261-Rv3194c重组菌及其突变株的生长曲线，可以发现其与亲本菌株（Ms）在生长速率上并无差异。在抑制巨噬细胞功能和降解补体分子方面，用Rv3194c与其突变体蛋白Rv3194cM（D308A、S309A）分别作用诱导分化的THP-1巨噬细胞后发现，在蛋白处理细胞12h后，对照组的划痕愈合了约69.47%，而Rv3194c蛋白处理后的细胞，划痕愈合了约28.97%，突变体蛋白Rv3194cM处理后的细胞，划痕愈合了约47.23%。作用24h后的对照组细胞划痕愈合了约90.57%，而Rv3194c处理的巨噬细胞，细胞划痕愈合率约为47.2%，Rv3194cM实验组的细胞划痕愈合率约为69.29%，结果表明Rv3194c蛋白可明显抑制巨噬细胞的迁移。纯化的Rv3194c蛋白可以体外降解补体成分C3中的C3b，从而抑制THP1巨噬细胞对耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌的吞噬作用。同时，Rv3194c也能够降解补体成分C5中的C5a分子，从而抑制THP1巨噬细胞的趋化作用。在Rv3194c致病性研究方面，用三组重组菌（Ms-261，Ms-261-Rv3194c，Ms-261-Rv3194cM）分别感染C57BL/6小鼠，结果发现，表达空载体的重组菌Ms-261在感染小鼠14d时，肺内的重组菌可被完全清除，表达Rv3194c突变体的重组菌（Ms-261-Rv3194cM）在肺内的持留时间直到28d时才被完全清除，而表达Rv3194c蛋白的重组耻垢分枝杆菌在感染后的28d时仍然存在于感染小鼠的肺部，结果表明重组菌Ms-261-Rv3194c与其突变体Ms-261-Rv3194cM相较于Ms-261在感染小鼠后均能够提高耻垢分枝杆菌在小鼠肺脏内的定殖与持留。病理组织学研究发现Rv3194c可以诱导小鼠肺脏产生出血性变性和炎性细胞因子的浸润等组织病理学变化。对不同时间点感染后小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中细胞因子的检测发现，Rv3194c可以显著提高IFN-γ、IL-1β、TNF-α和IL-6炎性细胞因子的分泌。本研究证明结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv3194c在结核分枝杆菌的致病性方面具有重要作用，有望为治疗结核病提供一个新的药物靶标。
众所周知，肺泡巨噬细胞是MTB主要感染及入侵的靶细胞，在MTB感染细胞的过程中，许多毒力因子都发挥了重要的作用。而丝氨酸蛋白酶类是MTB的一类重要的毒力因子，与菌体对巨噬细胞的侵袭以及在巨噬细胞中的持留密切相关，但该酶类的理化特性及其在致病性方面所扮演的具体作用仍有待进一步研究。
本研究利用生物信息学方法，分析了Rv3194c蛋白可能为MTB的一个潜在的胞外丝氨酸蛋白酶，在大肠杆菌中表达并纯化了结核分枝杆菌Rv3194c蛋白，实验证实了Rv3194c蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性：体外可以降解牛血清白蛋白（BSA）、牛乳（Milk）、酪蛋白（Casein）及明胶（Gelatin），同时在485nm激发波长和535nm吸收波长的条件下能够检测到Rv3194c降解荧光标记的酪蛋白（FITC-Casein）所发出的荧光。进一步的实验表明，Rv3194c蛋白发挥丝氨酸蛋白酶活性所需的最佳温度为40℃、最适pH值为8.0，同时二价金属离子Mn2+离子和Ca2+离子可以促进其酶活性的发挥。体外抑制剂筛选结果表明，中药单体-桦木酸及化学抑制剂-PMSF和Roche inhibitor cocktail能够有效抑制Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性。定点突变研究结果显示，突变S253、G254、S86、G87、D308和S309位点可以降低Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性，特别是D308和S309位点对Rv3194c的丝氨酸蛋白酶活性起着关键性的作用，可降低Rv3194c蛋白酶70%的酶活性。
将rv3194c基因及其突变体rv3194cM（D308A和S309A）基因连接到pMV261-AI-N穿梭载体构建重组质粒pMV261-rv3194c及pMV261-rv3194cM，测序鉴定成功后将重组质粒与空载体质粒分别电击转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Ms）中，构建重组耻垢分枝杆菌Ms-261-Rv3194c、突变体菌株Ms-261-Rv3194cM及含有空载体的重组耻垢分枝杆菌Ms-261。亚细胞定位分析，结果表明在重组耻垢分枝杆菌及BCG中Rv3194c蛋白均能够在菌体组分全菌体、胞壁、胞浆、胞膜中被检测到，同时Rv3194c蛋白能够在重组耻垢分枝杆菌的培养滤液中被检测到，表明Rv3194c可能为结核分枝杆菌的一个潜在的胞外丝氨酸蛋白酶。同时体外测定Ms-261-Rv3194c重组菌及其突变株的生长曲线，可以发现其与亲本菌株（Ms）在生长速率上并无差异。在抑制巨噬细胞功能和降解补体分子方面，用Rv3194c与其突变体蛋白Rv3194cM（D308A、S309A）分别作用诱导分化的THP-1巨噬细胞后发现，在蛋白处理细胞12h后，对照组的划痕愈合了约69.47%，而Rv3194c蛋白处理后的细胞，划痕愈合了约28.97%，突变体蛋白Rv3194cM处理后的细胞，划痕愈合了约47.23%。作用24h后的对照组细胞划痕愈合了约90.57%，而Rv3194c处理的巨噬细胞，细胞划痕愈合率约为47.2%，Rv3194cM实验组的细胞划痕愈合率约为69.29%，结果表明Rv3194c蛋白可明显抑制巨噬细胞的迁移。纯化的Rv3194c蛋白可以体外降解补体成分C3中的C3b，从而抑制THP1巨噬细胞对耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌的吞噬作用。同时，Rv3194c也能够降解补体成分C5中的C5a分子，从而抑制THP1巨噬细胞的趋化作用。在Rv3194c致病性研究方面，用三组重组菌（Ms-261，Ms-261-Rv3194c，Ms-261-Rv3194cM）分别感染C57BL/6小鼠，结果发现，表达空载体的重组菌Ms-261在感染小鼠14d时，肺内的重组菌可被完全清除，表达Rv3194c突变体的重组菌（Ms-261-Rv3194cM）在肺内的持留时间直到28d时才被完全清除，而表达Rv3194c蛋白的重组耻垢分枝杆菌在感染后的28d时仍然存在于感染小鼠的肺部，结果表明重组菌Ms-261-Rv3194c与其突变体Ms-261-Rv3194cM相较于Ms-261在感染小鼠后均能够提高耻垢分枝杆菌在小鼠肺脏内的定殖与持留。病理组织学研究发现Rv3194c可以诱导小鼠肺脏产生出血性变性和炎性细胞因子的浸润等组织病理学变化。对不同时间点感染后小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中细胞因子的检测发现，Rv3194c可以显著提高IFN-γ、IL-1β、TNF-α和IL-6炎性细胞因子的分泌。本研究证明结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv3194c在结核分枝杆菌的致病性方面具有重要作用，有望为治疗结核病提供一个新的药物靶标。