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分泌型杀虫蛋白（Secreted insecticidal protein,Sip）是一类在苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）生长代谢过程中分泌的杀虫蛋白,其与已知的Cry蛋白和Vip蛋白没有同源性,对鞘翅目害虫具有良好的杀虫活性。目前对Sip蛋白杀虫机理知之甚少,本研究通过生物信息学分析构建突变体,获得突变氨基酸位点与杀虫活性的对应关系。对其结构与功能的关系、杀虫机制研究和延缓害虫抗药性,具有重要的研究及应用前景。利用同源建模等生物信息学研究手段,对Sip1Aa蛋白的三维结构进行初步预测,选择其保守结构域中部分酸性和碱性氨基酸残基进行研究。利用PCR介导的定点突变技术,以甲基化的p ET-sip1Aa重组质粒为模板,将H99、K109、K128、E130、D134、D136、D141、K145、K193、H242、H259、D290、R292、D299、H303、H318和D328这18个氨基酸位点进行丙氨酸扫描突变,成功构建了18个突变体。SDS-PAGE分析显示,18个突变体均能够产生大小约37.6 k Da的可溶性蛋白,说明突变未破坏蛋白质的高级结构。以大猿叶甲（Colaphellus bowringi Baly）作为供试昆虫,对突变蛋白进行杀虫活性测定。K109A、K128A和E130A对大猿叶甲的杀虫活性显著提高,以K128A的杀虫活性变化最为明显,LC50值为0.18μg/m L,比Sip1Aa蛋白毒性提高了约10倍。E130A的LC50值为0.286μg/m L,比Sip1Aa蛋白毒性提高了6倍,且K128和E130均处于β9-β10 Loop,推测这一Loop在Sip1Aa蛋白中处于重要位置。突变体D290A、H242A和H303A对大猿叶甲的毒性显著降低,可能这三个位点处于杀虫活性关键位置。本研究结果为揭示Sip1Aa蛋白的结构与功能关系提供了理论依据。为解决Sip1Aa蛋白在大肠杆菌中表达时产生大量不溶性包涵体的问题,提高可溶性蛋白产量,本研究应用重叠PCR技术,构建cry1Ac启动子指导Sip1Aa蛋白表达载体。探究Bt cry1Ac启动子指导Sip1Aa蛋白表达情况、杀虫活性及溶解性,并与T7启动子指导的Sip1Aa蛋白进行对比,同时初步探索其发酵条件。应用反向PCR的方法在重组质粒上添加组氨酸标签并成功纯化重组蛋白。结果显示,cry1Ac与T7启动子均能指导Sip1Aa表达37.6 k Da的可溶性蛋白,二者对大猿叶甲的杀虫活性无明显差异。cry1Ac启动子指导的Sip1Aa蛋白可溶组分显著高于T7启动子指导的Sip1Aa蛋白。当菌株生长达到饱和时,发酵时间对蛋白表达影响不大。为sip1Aa基因的快速表达提供新方法,为杀虫机理等研究提供新思路。为延缓昆虫抗性,本研究利用易错PCR技术构建Sip1Aa蛋白随机突变文库,随机选取100个阳性转化子进行测序,共产生25个突变体,分别命名为M1-M25。共发生29个碱基突变,平均每个突变体发生1.2个碱基突变。与野生型Sip1Aa蛋白相比,突变体M1（A31,Y118,D227）,M5（K168）和M21（I307）的杀虫活性明显降低,LC50值升高4-6倍。获得对大猿叶甲杀虫活性提高的突变体M8（R174S）,其LC50值降低了4倍。该研究结果为Sip1Aa蛋白的分子改造及杀虫活性关键位点的研究提供了借鉴。