论文部分内容阅读
由于恶性肿瘤发病率增加,近年来采用了大剂量的放、化疗或联合治疗恶性肿瘤,使大多数患恶性肿瘤的儿童的生存期大大延长,但是大剂量放化疗后的严重副作用之一是对女性患者生殖功能的严重或全部损坏,导致月经失调、卵巢早衰,甚至丧失生殖能力。另一方面,越来越多的女性由于职业竞争压力的增大而一再推迟生育年龄,给优生优育带来了隐患。如何充分利用生殖资源保存女性特别是接受抗癌治疗患者的生育能力,解除职业女性的后顾之忧成为近年来生殖医学研究的热点。目前,保存卵巢生殖功能的方法有以下几种:冷冻卵母细胞、卵巢手术移位、药物保护卵巢功能以及冷冻卵巢皮质。相对于前几种方法而言,卵巢组织冷冻是一种较为理想的大量保存原始卵泡的方法,因为原始卵泡的许多特征使其不易受到冷冻损伤,比胚胎和卵子冷冻保存更具潜力,适于青春期前、青春期和育龄期的女性,不依赖于年龄和月经周期,不需要卵巢刺激延迟抗癌治疗。有报道通过卵巢组织片慢速冷冻-解冻后自体移植不仅恢复了自然月经,并通过IVM-ET成功受孕与分娩,卵巢组织的冷冻保存可能成为女性较为可靠的卵巢功能保存的方法。以往的卵巢组织冷冻研究以慢速冷冻-快速复温法为主,但是卵巢组织中含有多种类型的细胞,对冷冻平衡的要求各不相同,因此导致慢速冷冻法对卵巢组织损伤较大,效果差。玻璃化冷冻技术是将卵巢组织片放置在较高浓度的冷冻保护剂中平衡一段时间后直接投入-196℃的液氮中快速降温,使卵巢组织在短时间内无法形成冰晶而直接形成“玻璃样”固态,相对于慢速冷冻而言是一种操作简单、仪器设备要求较低、较有前途的冷冻方法,玻璃化冷冻较早应用于人类胚胎、囊胚和卵母细胞的冷冻保存,获得较好的冷冻保存效果且均已获得活产。因此,玻璃化冷冻技术日益受到重视,成为卵巢功能保存研究的新热点。本研究欲采用此方法行卵巢组织的冷冻保存,并通过体外培养评估冷冻-解冻后卵巢组织的活力保存情况。在卵泡生长发育过程中有几个主要步骤,包括原始卵泡向初级卵泡转化,初级卵泡向次级卵泡转化、选择和闭锁,其中两次转化被认为是卵泡生长过程中的限速步骤。目前对人原始卵泡向初级卵泡转化的具体机制还不清楚。近年来,人们在探索原始卵泡向初级卵泡转化机制及降低卵泡体外培养中卵泡闭锁率的过程中将目光转向生长因子,有研究表明转移生长因子超家族中的骨形态发生蛋白(BMPs)家族参与了这一过程。BMPs是转移生长因子-β(TGF-β)超家族中最大的一个家族,至今有约15种BMP被报道。其中BMP-4最初命名是由于其在骨和软骨代谢中的作用,在哺乳动物卵巢中的功能首先由Shimasaki等在1999年报道。目前认为BMP-4在小鼠卵巢中的表达部位是窦前卵泡的卵泡膜细胞,而其受体是在颗粒细胞和卵母细胞中表达,通过自分泌/旁分泌方式调节卵巢内卵泡生长发育、存活和内分泌变化。有研究显示,在新生小鼠卵巢的体外培养过程中,加入重组人BMP-4可以显著促进原始卵泡向初级卵泡的转化,同时降低卵泡的凋亡率。另有实验表明重组人BMP-4可以调节FSH的信号传导,促进雌二醇的产生,同时抑制孕激素的生物合成,被称为“黄体化抑制剂”。根据对羊的研究提示,BMP-4不仅可以抑制FSH诱导的孕激素合成,而且能抑制无FSH时的基础孕激素合成,说明BMP-4在卵泡生长发育和存活方面可能发挥重要作用。目前尚未见到BMP-4在人卵巢组织玻璃化冷冻-解冻后体外培养中对卵泡作用的相关报道。目的本实验将玻璃化冷冻后人卵巢组织行体外培养,评估冷冻后人卵巢组织的活力;同时在培养过程中加入重组人BMP-4,探讨其在玻璃化冷冻后人卵泡的生长、转化和存活方面的作用,分析其对卵泡分泌活动的影响,同时探讨BMP-4对卵泡雌孕激素分泌活动影响的可能机制,为进一步研究卵泡生长转化机制和卵巢组织冷冻保存及卵泡体外培养技术的临床应用提供理论基础和实验依据。材料与方法1.组织来源选取广州医学院附属广州市第一人民医院妇产科2008年4月至11月进行卵巢手术的女性患者32例作为研究对象,患者年龄29.66±4.25岁(16～37岁),有规律月经、无内分泌紊乱、无放化疗史、半年内无激素服用史且卵巢囊肿直径<7cm。2.实验方法2.1卵巢组织冷冻及培养:将在开腹手术或腹腔镜下获得的卵巢组织标本立即放置在室温保存的HEPES- MEM培养液中,30分钟内送至实验室,在室温下用HEPES-MEM培养液冲洗两次后,移入装有该液体的培养皿中。修剪卵巢组织并切除卵巢髓质,然后将卵巢皮质切成2mm×2mm×1mm的皮质片,将来自同一患者的皮质片随机分为新鲜卵巢组织(A组)、玻璃化冷冻复温后卵巢组织:未培养组(B组)、基本培养液培养组(C组)和BMP-4培养液组(D组),基本培养液组和BMP-4培养液组于37℃,5%CO2培养箱中培养15天,每隔两天更换400μl培养液,更换过的培养液收集到EP管中于-20℃保存,培养结束后进行雌孕激素测定。2.2组织学检查:将新鲜卵巢组织和玻璃化冷冻后未培养组,基本培养液及BMP-4培养液组分别体外培养15天后的卵巢组织行组织学检查,切片厚度5μm,间隔50μm将切片行HE染色阅片,计数其中原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡,计算四组原始卵泡和生长卵泡(包括初级和次级卵泡)所占百分比,以及冷冻前后形态正常的原始卵泡和初级卵泡百分率。2.3雌孕激素测定:所有组织培养结束后,将贮存的装有更换过培养液的EP管于室温下解冻,并将每一标本的培养液集中于测定管中,用ADVIA Centaur自动化学发光免疫分析仪进行培养液中雌孕激素测定。结果1.冷冻对卵巢组织中各级卵泡比例的影响冷冻后的卵巢组织与新鲜组比较,原始卵泡、生长期卵泡(初级卵泡以及次级卵泡)占总卵泡的比例差异均无显著性(P>0.05)。2.冷冻对卵巢组织中各级卵泡的形态影响玻璃化冷冻后形态正常的原始卵泡及初级卵泡百分率,与新鲜卵巢组相比均无明显差异(P>0.05)。3. BMP-4对冷冻后卵泡生长发育的影响玻璃化冷冻卵巢组织解冻后培养15天,培养结束后基本培养液组(C组)和BMP-4组(D组)平均有53.29±18.26%和43.38±22.59%的卵泡处于原始卵泡阶段,显著低于未培养组的原始卵泡所占比例84.63±8.01%,P<0.01,而C和D组之间无统计学差异(P>0.05)。基本培养液组和BMP-4组平均有46.71±18.26%和56.62±22.59%的卵泡是生长期卵泡,两组之间差异无显著性(P>0.05),但明显高于未培养组的生长卵泡所占比例15.37±8.01%,P<0.01。4. BMP-4对基础雌孕激素分泌的影响培养结束后,基本培养液组和BMP-4组中雌二醇的含量分别是1011.13±321.50ng/L和1186.17±405.78ng/L ,BMP-4组雌激素含量稍增高,但无统计学意义(P>0.05);基本培养液组和BMP-4组孕激素的含量分别是7.02±3.09ug/L和4.61±2.69ug/L,有统计学意义(P<0.05)。结论1.冷冻保存人类卵巢组织,可以保存大量的原始卵泡和较多的初级卵泡。2.玻璃化冷冻可以较好的保存人类卵巢组织中原始和初级卵泡的形态,对卵泡体外生长影响较小,操作简便,是人类卵巢组织较适宜的冷冻保存方法。3. BMP-4有助于冷冻后人类卵巢组织体外培养中原始卵泡向初级卵泡的转化。4. BMP-4可以降低体外培养中颗粒细胞孕激素的基础分泌,对雌激素的分泌可能有促进作用。