论文部分内容阅读
目的探讨表皮生长因子(EGF)对人视网膜色素上皮细胞(hRPE)表达整合素α5的调节及意义。方法1)通过玻璃体切除术采集14例视网膜脱离病例的视网膜下膜标本,用免疫组化方法检测下膜中角蛋白,整合素α5β1及纤维粘连蛋白(FN)的表达。免疫荧光双标记法研究视网膜下膜色素上皮细胞与整合素α5β1表达的关系,荧光定量分析视网膜下膜与正常视网膜下膜组织中整合素α5β1表达的差异。2)人视网膜色素上皮细胞原代、传代培养;分别用0ng/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、100 ng/ml浓度EGF诱导hRPE;RT-PCR、免疫组化和流式细胞术观察整合素α5mRNA和蛋白的表达;MTT法检测各实验组细胞增生率,采用直径为8.5mm的Boyden小室实验进行细胞迁移能力的检测。3)将实验分成对照组、10ng/mlEGF组和PD98059组,RT-PCR及流式细胞术观察不同实验组整合素α5 mRNA和蛋白的表达;Western blot法检测各组hRPE细胞中MAPK磷酸化水平。结果1)所有14例下膜标本中整合素α5β1纤维粘连蛋白(FN)表达均呈阳性,角蛋白表达均呈阳性的细胞(即RPE细胞)的细胞膜上表达整合素α5β1,与正常视网膜组织比较表达显著增强(P<0.05)。2)与0ng/ml组相比,24h后1ng/ml的EGF促进人hRPE细胞中整合素α5mRNA和蛋白的表达,并呈浓度依赖性,而浓度为10～100ng/ml时促进作用达到高峰。流式细胞术检测显示:10ng/ml的EGF作用时荧光强度最强为3.98±0.67,0ng/ml和0.1ng/ml组分别为1.87±0.22,1.98±0.54(P<0.01)。MTT法检测显示:与对照组相比,EGF组及加入不相关抗体(兔抗人波形蛋白抗体)组细胞增生、迁移明显,而加入兔抗人整合素α5多克隆抗体(1:100)组较弱,与前两组相比差异有显著性(P<0.01)。3)与对照组相比,EGF促进整合素α5 mRNA和蛋白的表达,而PD98059(20μmol/L)可抑制此促进作用;流式细胞术显示24 h后整合素α5荧光强度分别为1.94±0.22,4.56±0.25,2.39±0.14,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示30 min后EGF组ERK1/2磷酸化激活水平最高,PD98059组抑制ERK1/2的磷酸化激活,对照组ERK1/2的磷酸化激活作用很弱。结论在视网膜下膜组织中hRPE细胞整合素α5β1表达上调,其配体FN也显著表达,整合素α5β1与FN参与了视网膜下膜的形成。1ng/ml的EGF开始促进整合素α5mRNA和蛋白的表达,10～100ng/ml时候促进作用达到高峰,整合素α5的表达促进hRPE细胞的增生和迁移。ERK1/2的磷酸化激活参与此过程。EGF激活ERK1/2通路刺激hRPE细胞的整合素α5mRNA的表达是PVR的重要发病机制。