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目的:
放射治疗在临床上广泛用于前列腺癌治疗。但是在放疗过程中会逐渐产生放疗抵抗现象,尤其是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)更易出现,导致前列腺癌局部复发或远处转移。CRPC产生放疗抵抗现象的确切机制尚不清楚。PLCε目前被认为是一种癌基因,在前列腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。因此,本课题旨在研究PLCε调控CRPC放疗敏感性作用及分子机制,为CRPC治疗探索一种新策略。
方法:
(1)收集30例良性前列腺增生标本(BPH)、35例原发性前列腺癌标本(PPC)及27例去势抵抗性前列腺癌标本(CRPC),免疫组化检测PLC?、AR及DNA-PKcs的蛋白表达水平,统计分析上述三者在不同前列腺病理组织的表达差异。收集单发病灶的PPC标本4例及CRPC标本4例,Q-PCR检测癌组织及癌旁组织中PLC?和AR的mRNA表达情况,Westernblot检测蛋白表达情况。统计分析PLC?和AR在PPC和CRPC标本中的表达与临床病理参数的关系。
(2)培养雄激素敏感性前列腺癌细胞株LNCaP,构建并培养比卡鲁胺及恩杂鲁胺耐药细胞株Bica-R细胞和Enza-R细胞,Q-PCR及Westernblot检测三株细胞PLC?和AR的mRNA和蛋白表达情况。采用不同剂量的射线进行照射(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)上述三株细胞,MTT检测它们的细胞活性改变,Q-PCR及Westernblot检测PLC?和AR的mRNA和蛋白表达情况。采用慢病毒为载体的sh-RNA构建LNCaP细胞、Bica-R细胞和Enza-R细胞的PLC?敲低稳定转染株,Q-PCR检测PLC?和AR的mRNA表达情况。MTT、克隆形成和流式细胞(细胞周期)检测PLC?敲低和射线照射对细胞增殖能力的影响,流式细胞(凋亡)检测细胞凋亡的情况。
(3)培养比卡鲁胺及恩杂鲁胺耐药细胞株Bica-R细胞和Enza-R细胞,采用6Gy放射剂量进行射线照射。免疫荧光检测PLC?敲低上述细胞AR核转位的影响,Westernblot检测核、浆蛋白AR表达,进一步证实AR核转位改变,Q-PCR及Westernblot检测PLC?、AR、DNA-PKcs和H2AX的mRNA和蛋白表达情况。采用AR通路激活剂(DHT)和抑制剂(ARN-509)分别处理上述细胞,克隆形成实验和流式细胞技术分别检测细胞增殖能力和凋亡的改变,Q-PCR及Westernblot检测上述各处理组AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA及蛋白表达情况。采用PARP1抑制剂AZD2281处理上述细胞,Q-PCR及Westernblot检测AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA及蛋白水平改变。采用EZH2的特异性抑制剂DZNeP处理Bica-R细胞,Q-PCR检测AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA水平,Westernblot检测AR、PARP1、EZH2及H3K27me3的表达,CHIP-PCR检测DZNeP处理及PLC?敲低后PARP1启动子区域H3K27me3水平。
(4)采用裸鼠构建Bica-R细胞或PLC?敲低稳定株Bica-R细胞的皮下移植瘤,每天2Gy放射剂量,连续5天照射小鼠。观察移植瘤大小及重量变化,免疫组化检测移植瘤中PLC?、AR和DNA-PKcs蛋白表达情况。
结果:
(1)PLC?、AR及DNA-PKcs蛋白在CRPC标本中表达均显著高于PPC与BPH,且上述三者在PPC中的表达又均高于BPH。在PPC和CRPC中,癌组织的PLC?及AR的mRNA和蛋白水平高于癌旁组织。临床资料统计显示,PLC?和AR的表达与前列腺癌的Gleason评分具有显著相关性。
(2)PLC?和AR的mRNA和蛋白水平在CRPC细胞株中明显高于野生型LNCaP细胞株。射线照射能使野生型LNCaP细胞中AR及PLC?的mRNA表达呈剂量依耐性增高,但其对野生型LNCaP细胞及CRPC细胞株的细胞活性影响较小。采用慢病毒敲低PLC?表达后,AR的mRNA水平出现下调,MTT、克隆形成实验和流式细胞术提示敲低PLC?能明显抑制射线照射后的野生型LNCaP细胞及CRPC细胞株的增殖能力,并促进它们早期凋亡发生。
(3)PLC?敲低能够明显抑制射线照射后CRPC细胞株中AR核转位效应,下调AR和DNA-PKcs的mRNA表达,同时下调AR、DNA-PKcs和γ-H2AX的蛋白表达。在CRPC细胞中,AR通路的激活可以促进细胞增殖抑制细胞凋亡,相反,AR通路失活可以抑制细胞增殖促进细胞凋亡。此外,AR通路的激活或抑制分别可以引起AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA和蛋白水平上调或下降。采用PARP1抑制剂处理细胞能够导致AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA表达下调,同时引起AR、PARP1、γ-H2AX及DNA-PKcs蛋白水平下调。抑制上述细胞EZH2活性后,AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA水平下调,AR、PARP1、EZH2及H3K27me3的蛋白水平下调,CHIP-PCR实验提示PLC?敲低能够导致PARP1启动子区域H3K27me3水平上调,而EZH2抑制能够阻断这一过程。
(4)成功构建Bica-R细胞和PLC?敲低稳定株Bica-R细胞的皮下移植瘤。PLC?敲低能够明显增强移植瘤对放疗的敏感性,且PLC?敲低稳定株Bica-R细胞移植瘤中,AR、DNA-PKcs和γ-H2AX表达水平明显下调。
结论:
CRPC细胞中高表达的PLC?能通过AR依耐性及AR非依耐性通路维持PARP1高表达,最终引起DDR相关分子高表达,导致放疗抵抗的发生。PLC?/AR/PARP1/DNA-PKcs通路可能成为单独亦或联合放疗治疗CRPC的靶点之一。
放射治疗在临床上广泛用于前列腺癌治疗。但是在放疗过程中会逐渐产生放疗抵抗现象,尤其是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)更易出现,导致前列腺癌局部复发或远处转移。CRPC产生放疗抵抗现象的确切机制尚不清楚。PLCε目前被认为是一种癌基因,在前列腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。因此,本课题旨在研究PLCε调控CRPC放疗敏感性作用及分子机制,为CRPC治疗探索一种新策略。
方法:
(1)收集30例良性前列腺增生标本(BPH)、35例原发性前列腺癌标本(PPC)及27例去势抵抗性前列腺癌标本(CRPC),免疫组化检测PLC?、AR及DNA-PKcs的蛋白表达水平,统计分析上述三者在不同前列腺病理组织的表达差异。收集单发病灶的PPC标本4例及CRPC标本4例,Q-PCR检测癌组织及癌旁组织中PLC?和AR的mRNA表达情况,Westernblot检测蛋白表达情况。统计分析PLC?和AR在PPC和CRPC标本中的表达与临床病理参数的关系。
(2)培养雄激素敏感性前列腺癌细胞株LNCaP,构建并培养比卡鲁胺及恩杂鲁胺耐药细胞株Bica-R细胞和Enza-R细胞,Q-PCR及Westernblot检测三株细胞PLC?和AR的mRNA和蛋白表达情况。采用不同剂量的射线进行照射(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)上述三株细胞,MTT检测它们的细胞活性改变,Q-PCR及Westernblot检测PLC?和AR的mRNA和蛋白表达情况。采用慢病毒为载体的sh-RNA构建LNCaP细胞、Bica-R细胞和Enza-R细胞的PLC?敲低稳定转染株,Q-PCR检测PLC?和AR的mRNA表达情况。MTT、克隆形成和流式细胞(细胞周期)检测PLC?敲低和射线照射对细胞增殖能力的影响,流式细胞(凋亡)检测细胞凋亡的情况。
(3)培养比卡鲁胺及恩杂鲁胺耐药细胞株Bica-R细胞和Enza-R细胞,采用6Gy放射剂量进行射线照射。免疫荧光检测PLC?敲低上述细胞AR核转位的影响,Westernblot检测核、浆蛋白AR表达,进一步证实AR核转位改变,Q-PCR及Westernblot检测PLC?、AR、DNA-PKcs和H2AX的mRNA和蛋白表达情况。采用AR通路激活剂(DHT)和抑制剂(ARN-509)分别处理上述细胞,克隆形成实验和流式细胞技术分别检测细胞增殖能力和凋亡的改变,Q-PCR及Westernblot检测上述各处理组AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA及蛋白表达情况。采用PARP1抑制剂AZD2281处理上述细胞,Q-PCR及Westernblot检测AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA及蛋白水平改变。采用EZH2的特异性抑制剂DZNeP处理Bica-R细胞,Q-PCR检测AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA水平,Westernblot检测AR、PARP1、EZH2及H3K27me3的表达,CHIP-PCR检测DZNeP处理及PLC?敲低后PARP1启动子区域H3K27me3水平。
(4)采用裸鼠构建Bica-R细胞或PLC?敲低稳定株Bica-R细胞的皮下移植瘤,每天2Gy放射剂量,连续5天照射小鼠。观察移植瘤大小及重量变化,免疫组化检测移植瘤中PLC?、AR和DNA-PKcs蛋白表达情况。
结果:
(1)PLC?、AR及DNA-PKcs蛋白在CRPC标本中表达均显著高于PPC与BPH,且上述三者在PPC中的表达又均高于BPH。在PPC和CRPC中,癌组织的PLC?及AR的mRNA和蛋白水平高于癌旁组织。临床资料统计显示,PLC?和AR的表达与前列腺癌的Gleason评分具有显著相关性。
(2)PLC?和AR的mRNA和蛋白水平在CRPC细胞株中明显高于野生型LNCaP细胞株。射线照射能使野生型LNCaP细胞中AR及PLC?的mRNA表达呈剂量依耐性增高,但其对野生型LNCaP细胞及CRPC细胞株的细胞活性影响较小。采用慢病毒敲低PLC?表达后,AR的mRNA水平出现下调,MTT、克隆形成实验和流式细胞术提示敲低PLC?能明显抑制射线照射后的野生型LNCaP细胞及CRPC细胞株的增殖能力,并促进它们早期凋亡发生。
(3)PLC?敲低能够明显抑制射线照射后CRPC细胞株中AR核转位效应,下调AR和DNA-PKcs的mRNA表达,同时下调AR、DNA-PKcs和γ-H2AX的蛋白表达。在CRPC细胞中,AR通路的激活可以促进细胞增殖抑制细胞凋亡,相反,AR通路失活可以抑制细胞增殖促进细胞凋亡。此外,AR通路的激活或抑制分别可以引起AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA和蛋白水平上调或下降。采用PARP1抑制剂处理细胞能够导致AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA表达下调,同时引起AR、PARP1、γ-H2AX及DNA-PKcs蛋白水平下调。抑制上述细胞EZH2活性后,AR、PARP1及DNA-PKcs的mRNA水平下调,AR、PARP1、EZH2及H3K27me3的蛋白水平下调,CHIP-PCR实验提示PLC?敲低能够导致PARP1启动子区域H3K27me3水平上调,而EZH2抑制能够阻断这一过程。
(4)成功构建Bica-R细胞和PLC?敲低稳定株Bica-R细胞的皮下移植瘤。PLC?敲低能够明显增强移植瘤对放疗的敏感性,且PLC?敲低稳定株Bica-R细胞移植瘤中,AR、DNA-PKcs和γ-H2AX表达水平明显下调。
结论:
CRPC细胞中高表达的PLC?能通过AR依耐性及AR非依耐性通路维持PARP1高表达,最终引起DDR相关分子高表达,导致放疗抵抗的发生。PLC?/AR/PARP1/DNA-PKcs通路可能成为单独亦或联合放疗治疗CRPC的靶点之一。