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紫龙金片是获得中国国家药品监督局批准的抗癌新药,由黄芪、当归、龙葵、白英等八味中药合理配伍而成。临床应用现实,紫龙金片在治疗肝癌、肺癌、胃癌、前列腺、肾癌、乳腺癌及直肠癌等病症疗效显著,它不仅能够抑制肿瘤的原位生长,对肿瘤转移也有明显的抑制作用,其抑癌作用的分子机理值得深入研究。
本文以前列腺癌细胞系PC-3M为模型,利用MTT、流式细胞术、Transwell体外迁移、Matrigel侵袭实验等在细胞水平上探讨并验证了紫龙金对肿瘤细胞增殖和转移的影响。结果表明3mg/mL(生药量)紫龙金能够有效抑制PC-3M细胞的增殖,且处于G1期的细胞比例增加,G2/M期细胞比例降低,提示,紫龙金可能阻抑细胞G1期进程来抑制细胞增殖的。同样浓度的紫龙金处理PC-3M细胞后,发生迁移和侵袭的PC-3M细胞数目明显减少,表明紫龙金除抑制细胞增殖外,还能够抑制PC-3M细胞的体外迁移和侵袭能力。
为了系统阐释紫龙金抑癌作用的机理,本研究用半定量PCR和蛋白印迹技术对参与细胞增殖和转移的分子及调节这些分子表达的信号通路进行了检测。研究表明,紫龙金下调Cyclin D,c-Myc,p-Rb,p-PTEN,p53等蛋白的表达,上调p21,p27的表达,说明紫龙金是通过对细胞增殖相关分子的调节抑制PC-3M细胞增殖。此外,紫龙金能够抑制PKCa,ERK,p50,Snail的表达,下调MMP1,MMP2,MMP9,uPA,Cathepsin B等蛋白水解酶的表达,并降低明胶酶的活性,与此同时,上调E-cadherin和nm23-H1的表达。提示,紫龙金是通过MAPK信号通路和NF-KB信号通路调节与肿瘤转移相关的蛋白水解酶和细胞黏附分子的表达,进而抑制PC-3M的体外转移和侵袭的能力。这为紫龙金在临床上的应用增加了理论基础。
RKIP是通过双向电泳-质谱技术筛选出的紫龙金作用相关蛋白,已有报道指出它是一个新的肿瘤转移抑制因子,参与了对细胞内MAPK、G蛋白偶联受体和NF-κB等多种信号转导通路的调节作用。并且研究显示,RKIP表达水平与前列腺癌细胞的体外侵袭能力呈负相关,但其分子机理尚不清晰。本文用Transwell体外迁移、Matrigel侵袭等实验在细胞水平上探讨并验证了RKIP对肿瘤细胞PC-3M迁移和侵袭的影响。实验表明过表达RKIP的PC-3M细胞株RKIP发生迁移和侵袭的细胞数目明显减少,说明RKIP能够抑制PC-3M细胞的体外迁移和侵袭能力。
为了进一步探讨RKIP抑制肿瘤转移的作用机理,同样用半定量PCR和蛋白印迹技术对参与细胞转移的分子及调节这些分子表达的信号通路进行了检测。研究表明,RKIP下调信号通路中p-Rb(ser807/811),p-ERK(G-4),p-IKK(PS133)和p65的水平,同时下调了信号通路下游蛋白水解酶MMP2,MMP9,uPA,Cathepsin B的表达和活性,上调细胞黏附分子E-cadherin和肿瘤转移抑制因子nm23-H1的表达。值得一提的是在RKIP细胞中,转移促进因子S100A4的表达明显下调甚至无法检测,暗示S100A4可能是RKIP抑制肿瘤转移的关键因子。综上所述,RKIP是通过MAPK信号通路和NF-KB信号通路调节蛋白水解酶和细胞黏附分子的表达,抑制PC-3M的体外移和侵袭。