研究背景:　　牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一种来源于牙周膜的具有自我更新和多向分化能力的成体间充质干细胞。具有在特定的条件下分化为不同生物学功能细胞的潜力，是牙周组织工程实现细胞治疗无可争议的种子细胞。利用牙周膜干细胞修复因牙周炎症疾病造成的软硬组织缺损，诱导牙周膜干细胞分化为成骨细胞、成牙骨质细胞或成纤维细胞从而使支持牙齿的牙槽骨获得一定程度的再生，一直是学者们备受关注的重点。　　microRNA(miRNAs)是一种内源性非蛋白编码单链小分子RNA，主要通过切割或抑制翻译两种方式来抑制靶基因的表达。已有研究报道miRNAs在人牙周膜来源细胞成骨分化过程中异常表达，提示miRNAs对其成骨分化起到重要作用。本研究通过构建人PDLSCs成骨分化前后miRNAs表达谱，并根据条件筛选出差异表达的miR-543。进一步探究miR-543在人牙周膜干细胞成骨分化中的生物学作用及靶向调控TOB2(transducer of ERBB2，2，TOB2)的分子机制。实验所得结果为miRNAs在牙周来源的特异性间充质干细胞骨向分化过程的分子调控机制提供有力证据，进一步优化miRNAs介导的干细胞治疗方法。　　材料与方法:　　1.人牙周膜干细胞分离培养及鉴定　　本实验所用牙齿均为前磨牙或第三磨牙，采用改良组织块酶消化法分离培养细胞，利用有限稀释法对培养出的细胞进行分离纯化。CCK8方法检测细胞增殖能力，计算数据并绘制生长曲线。　　取第3代人牙周膜干细胞于流式细胞仪检测表面分子标记物，并利用免疫细胞化学技术检测波形丝蛋白和角蛋白的表达。倍比稀释法将人牙周膜干细胞接种于培养皿中，观察细胞单克隆形成情况并计算克隆形成率。　　对培养的人牙周膜干细胞进行成骨、成脂诱导14 d后，分别用茜素红S及油红O染色剂染色，倒置显微镜下观察分化能力。　　2.人牙周膜干细胞骨向分化miRNAs表达谱的构建及验证　　Trizol法分别提取正常培养对照组和成骨诱导组细胞的总RNA。NanoDropND-1000紫外分光光度计检测浓度与纯度后，采用Exiqon公司的miRCURYTMLNA Array(v.18.0)芯片，对以上两组细胞内miRNAs表达进行检测，每组检测重复分别3次。SYBR Green法对芯片结果及成骨相关基因进行检测，以2-△△Ct值代表基因相对表达强度。　　3.miR-543的骨向分化功能学研究　　构建miR-543慢病毒，预实验确定最佳转染复数，qRT-PCR技术检测慢病毒转染效率。按照实验设计进行分组进行转染，分别提取成骨诱导14 d后各组总RNA及蛋白， qRT-PCR佥测成骨相关基因的表达变化，并在成骨诱导14 d后进行茜素红S及ALP染色检验慢病毒对成骨分化能力的影响。　　4.miR-543靶基因的预测及靶向调控TOB2结合位点的验证　　利用Targetscan、miRMap和MiRanda数据库预测miR-543靶基因，取预测结果交集靶位点的mRNA TOB2、NOTCH2、ACVR2A、BMP2进行基因和蛋白水平变化的验证。构建miR-543、TOB2野生型及突变型载体质粒，通过双荧光素酶报告检测二者间的结合位点。　　5.统计学分析　　本实验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，以(x)±S表示，用两独立样本t检验进行两组间比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　结果:　　1.人牙周膜干细胞分离培养及鉴定　　实验成功分离培养人牙周膜干细胞，经成骨及成脂向诱导后可见大量矿化结节和橘红色脂滴聚集。流式细胞术检测显示细胞阳性表达间充质干细胞表面标记物，阴性表达造血干细胞表面标记物。角蛋白表达为阴性，波形丝蛋白表达为阳性，提示细胞为间充质来源。　　2.成骨诱导前后miRNAs及成骨相关mRNA差异表达情况　　miRNAs基因芯片检测结果显示共有116个miRNAs出现差异表达，其中30个上调表达，86个下调表达。qRT-PCR验证成骨相关mRNA在成骨诱导后表达明显升高，选择miR-543作为关键基因深入研究。　　3.miR-543的功能研究　　转染miR-543过表达慢病毒组的成骨能力较常规培养组明显增强，抑制表达慢病毒组几乎观察不到矿化结节，结果提示miR-543对人牙周膜干细胞成骨向分化有明显的调控作用。　　4.miR-543靶基因预测及双荧光素酶报告　　取三个数据库预测靶基因结果的交集，最终选择TOB2、NOTCH2、ACVR2A、BMP2进行下一步验证。　　数据库预测miR-543与TOB2结合位点为GAAUGUU，双荧光素酶报告证实miR-543能够与TOB23UTR在此序列进行有效结合，发挥抑制效应，从而发挥促进人牙周膜干细胞成骨分化的过程。　　结论:　　(1)本研究成功分离获得并培养人牙周膜干细胞，验证其有在体外克隆形成及成骨、成脂分化的能力。　　(2)人牙周膜干细胞成骨分化前后存在差异表达miRNAs，验证miR-543为关键基因;　　(3)miR-543在人牙周膜干细胞成骨向分化过程中起到明显的调控作用。通过生物信息学预测miR-543靶基因可能为TOB2。　　(4)miR-543与TOB2在3UTR上存在结合位点，双荧光素酶报告结果提示miR-543发挥抑制TOB2表达的作用，促进成骨分化过程。