论文部分内容阅读
前列腺癌(prostate cancer,PCa)是欧美国家常见的肿瘤,居男性肿瘤死亡原因第二位,仅次于肺癌。我国前列腺癌的发病率虽低于西方国家,但随着生活水平的提高及人口老龄化发展,其发病率正迅速上升,成为危害中老年男性健康的主要疾病。前列腺癌的发病及恶化转移机制复杂,不仅与种族,饮食、生活习惯等关系密切,并且癌基因和抑癌基因及其相应的信号通路的异常调控直接参与了前列腺癌的发生、发展[1，2]。Vanaja等[3］根据芯片结果分析PDLIM4(PDZ and LIM domain 4)基因在前列腺癌中表达发生沉默。PDLIM4基因,又称RIL(reversion-induced LIM gene),是定位于5号染色体长臂上31.1的抑癌基因,编码含PDZ和LIM区域的蛋白,生物学功能目前尚未清楚[4,5]。研究发现PDLIM4基因在正常细胞中普遍表达,而在肿瘤细胞中常发生缺失,通过稳定转染恢复表达可以抑制肿瘤细胞增殖和集落形成,并促进细胞发生凋亡[6］。初步认为具有抑癌基因的功能。目前研究表明,PDLIM4氏表达与杂合子缺失、启动子区域CpG岛的异常高甲基化密切相关,且PDLIM4甲基化失活常和前列腺癌预后较差相关［6，7］。DNA甲基化是表观遗传学主要研究内容之一。DNA甲基化主要指基因启动子区域CpG岛中胞嘧啶C发生甲基化,由于DNA甲基化是一个可逆的过程,通过药物逆转启动子区域的甲基化可使沉默的基因恢复表达[8-11］。A甲基化可导致抑癌基因转录失活,进而影响肿瘤的发生发展[12-15］。人前列腺癌中PDLIM4基因启动子核心区域中含有多个CpG岛,已证实其CpG岛高度甲基化与PDLIM4表达下调密切相关但其调控机制尚不明确。我们首先通过免疫组化检测中国汉族人群中前列腺癌患者PDLIM4在前列腺增生组织及前列腺癌组织中的表达,已确定该基因的表达是否存在种族差异。同时检测相关的甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)DNMT3A及DNMT3B在相应组织中的表达水平。结果显示在前列腺癌组织中PDLIM4的表达明显低于正常癌旁组织及前列腺增生组织,与国外的研究报道一致,表明该基因的表达无显著的种族差异。而DNMT3A及DNMT3B表达在增生组织及癌组织中无明显差异。为了研究PDLIM4基因在前列腺癌中低表达的调控机制,我们通过Western blotting确定前列腺癌激素依赖及非依赖细胞株中PDLIM4蛋白的表达水平。结果显示,PDLIM4在正常人前列腺永生细胞株RWPE1中表达,而在激素非依赖的前列腺癌细胞PC-3、激素依赖的LNCaP中表达沉默。经过甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理后,LNCaP细胞中PDLIM4的表达明显上调,而RWPE1和PC3表达未发生明显改变,表明PDLIM4的表达不仅与其启动子CpG岛甲基化有关,可能还存在其它的调控机制。由于PDLIM4的表达调控发生在转录水平,我们以基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得PDLIM4基因启动子序列片段,插入到pGL3-Basic报告基因载体,分别得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因启动子的两个报告基因质粒pGL3-PDLIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb。另外,pGL3-PDLIM4-1.2kb质粒运用外切酶Ⅲ将启动子从5’端截短获得系列不同短片段的启动子序列,并构建其荧光素酶报告基因的重组质粒,得到5个含不同长度启动子序列的报告基因载体：pGL3-PDLIM4-970bp,pGL3-PDLIM4-803bp, pGL3-PDLIM4-653bp, pGL3-PDLIM4-645bp,pGL3-PDLIM4-627bpo利用PDLIM4启动子及其不同截短体报告基因转染不同组织来源细胞系及各前列腺细胞株,检测其表达情况。结果表明,PDLIM4基因长片段的3kb和1.2kb启动子荧光素酶质粒,在乳腺癌细胞株、宫颈癌细胞株、入口腔上皮肿瘤细胞株、前列腺癌细胞株中均有不同程度的表达活性,,其中在前列腺癌细胞株PC3、LNCaP中表达较低。而不同长度的PDLIM4启动子报告基因质粒转染PC-3、LNCaP的结果显示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表达活性最强,pGL3-PDLIM4-970bp表达活性最弱,说明在启动子-1275bp至-970bp区域内可能存在一个正调控元件。前列腺癌细胞株转染PDLIM4启动子,经5-aza-dc处理后,与未处理的细胞比较启动子活性变化。结果显示,LNCaP经5-aza-dc处理后PDLIM4的启动子活性明显上调(P＜0.05),而PC-3经5-aza-dc处理后启动子活性发生下调,RWPE1未发生明显改变。经5-aza-dc处理后启动子活性的变化与蛋白表达水平的变化相一致。说明了甲基化在激素依赖的LNCaP是主要的调控机制,而在激素非依赖的PC-3细胞中可能存在非甲基化调控机制。综上所述,抑癌基因PDLIM4在中国汉族人群前列腺癌组织和激素依赖的前列腺癌细胞中沉默,其启动子区域的甲基化对基因的沉默起着重要作用,去甲基化后可使PDLIM4在转录和蛋白翻译水平上恢复表达。而在激素非依赖的前列腺癌细胞中,其表达可能存在其他的调控机制,需要进一步的研究探索。