骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs）由于其具备来源丰富、可多向分化、且免疫原性低等优势,已广泛应用于组织修复、血管新生和细胞治疗,是再生医学研究中的重要种子细胞。然而BM-MSCs本身的生存环境氧浓度仅为2-8%,且当BM-MSCs移植入体内时也会遭遇低氧（Hypoxia）的病理生理环境。但目前常规的体外细胞实验通常都是在21%的正常氧浓度下进行,这与BM-MSCs的生理微环境,以及移植入体内的微环境不符。因此,研究低氧对BM-MSCs的生长以及分化等生物学行为的影响及其相关机制至关重要。氧不仅是生命体生存的必要条件,也是维持能量代谢及细胞功能的重要调节因素。但机体多种细胞都是处于生理或病理性低氧状态中。当氧供应不足时,低氧的信号即会迅速传递至细胞内,启动相关基因及蛋白的表达,从而维持细胞和机体内的平衡。肌红蛋白（Myoglobin,Mb）作为一种十分重要的含铁携氧珠蛋白,其贮存和运输氧的功能已被人们所熟知,然而Mb还存在多重生物催化功能,如过氧化物酶（Peroxidase）和水解酶（Hydrolase）催化活性等。在不同生理与病理条件下,Mb的生物学功能也有所不同。在低氧状态下,Mb具有一项非常重要的功能——亚硝酸盐还原酶（Nitrite reductase,NIR）催化活性,低氧时Mb血红素中心的铁可与亚硝酸盐（nitrite,NO₂ˉ）结合,进而催化其还原生成一氧化氮（nitric oxide,NO）（NO₂ˉ+deoxy Mb（Fe 2+）+2 H+→NO+met Mb（Fe 3+）+H2O）。研究发现,低氧条件下,NO能通过抑制缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a）的降解,促进多种生长因子的表达,调节细胞对低氧的应答,进一步影响细胞的生物学功能。Mb作为具有NIR催化活性的血红素蛋白,对氧浓度的改变极其敏感,但其在BM-MSCs中能否通过调节NO的生成,从而影响干细胞的增殖与分化目前尚不明了。本实验通过模拟骨髓内的低氧张力（2%O₂）对猪骨髓间充质干细胞（Porcine bone marrow mesenchymal stem cells,p BM-MSCs）进行体外培养,并诱导其向内皮细胞定向分化;并探讨Mb在低氧状态下对p BM-MSCs向内皮细胞分化中的作用及其可能机制。第一部分:低氧促进猪骨髓间充质干细胞定向分化为内皮细胞目的:观察骨髓生理低氧浓度对猪骨髓间充质干细胞（p BM-MSCs）向内皮细胞定向分化的影响。方法:采用密度梯度离心与贴壁筛选法相结合的方法分离培养p BM-MSCs。通过显微镜下观察细胞形态学变化,采用流式细胞仪对p BM-MSCs的纯度进行鉴定。分别于常氧（21%）及低氧（2%）条件下体外诱导p BM-MSCs定向分化为内皮样细胞,然后采用实时荧光定量PCR（Quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）以及Western blot法检测p BM-MSCs诱导分化后内皮细胞特异性标志物血管内皮钙黏蛋白（VE-Cadherin）与血管性假血友病因子（von Willebrand factor,v WF）的m RNA和蛋白表达水平。细胞活性检测试剂CCK-8检测低氧对p BM-MSCs增殖的影响,血管生成实验检测低氧对p BM-MSCs诱导分化后细胞成管能力的影响。结果:经显微镜下观察以及流式细胞术分析,本实验获得的细胞为干细胞表面标志物CD44/CD90双阳性高达96.3%,CD14/CD45双阴性率为95.8%的高纯度p BM-MSCs。常氧下采用内皮细胞完全培养基（EBM-2）和EBM-2+VEGF-A165（50 ng/m L）分别作为诱导分化培养基,体外诱导分化10天后,可见细胞形态发生了明显的变化:由长梭形变为圆形或椭圆形,且具有内皮细胞特征性的铺路石样排列。q RT-PCR与Western blot检测均显示诱导分化组内皮细胞特异性标志物VE-Cadherin与v WF的表达高于未诱导组（P<0.05）,说明p BM-MSCs可在常氧下定向诱导分化为内皮样细胞。采用CCK-8监测p BM-MSCs在低氧及常氧下的增殖情况,结果显示低氧能促进p BM-MSCs的增殖。接下来分别在低氧及常氧条件下利用EBM-2对p BM-MSCs进行定向诱导72 h。q RT-PCR以及Western blot检测结果均提示低氧下能促进p BM-MSCs定向分化为高表达VE-Cadherin与v WF（与常氧诱导组相比,P<0.01）的内皮样细胞,且在72 h即能显示出明显的诱导效果;体外血管生成实验也发现低氧诱导下的p BM-MSCs具有更强的血管生成能力。以上结果说明低氧能促进p BM-MSCs体外定向分化为内皮样细胞。第二部分:肌红蛋白的结构与NIR功能目的:探讨人肌红蛋白（human myoglobin,h Mb）及其突变体蛋白C110A-h Mb的结构以及在低氧下的NIR活性。方法:本实验采用氨基酸定点突变技术构建h Mb突变体蛋白C110A-h Mb基因,并通过表达纯化获得h Mb及C110A-h Mb两种蛋白。利用氨基酸序列比对,聚丙烯凝胶电泳以及紫外-可见光谱（UV-vis）分析两种蛋白的光谱学特征和血红素活性中心构象的差别,并采用吡啶光谱法测定两种蛋白的摩尔消光系数。采用紫外动力学以及电子顺磁共振（Electron paramagnetic resonance,EPR）波谱方法比较h Mb,C110A-h Mb以及野生型抹香鲸Mb（Sperm whale myoglobin,sw Mb）的NIR催化活性。结果:h Mb是唯一具有半胱氨酸（Cysteine,Cys）残基的Mb,为了解Cys对h Mb结构与功能的影响,本实验采用定点突变方法构建了突变体基因,成功转化后,抽提质粒测序正确,h Mb及C110A-h Mb质粒均为目标基因。通过表达、纯化获得以上两种蛋白。聚丙烯凝胶电泳发现h Mb存在二聚体形式,而C110A-h Mb仅以单体形式存在,说明Cys是导致h Mb出现二聚体的关键原因（蛋白质-蛋白质间形成二硫键）。进一步通过紫外-可见光谱分析发现,两种蛋白均存在特征性吸收峰:409 nm的Soret峰以及500 nm和625 nm的α/β吸收峰,这与野生型sw Mb的紫外光谱图非常相似,说明二聚体的存在并没有影响Mb的血红素活性中心的构象。利用紫外动力学检测方法测定还原态Mb催化NO₂ˉ还原为NO的动力学参数,并进一步通过二级反应速率的测试进行比较,发现突变体蛋白C110A-h Mb与野生型sw Mb的NIR活性极其相似,且稍高于h Mb。接着通过EPR波谱观察,同样证实在低氧条件下,h Mb及C110A-h Mb以及sw Mb均具有类似的NIR活性,能促进NO的产生。以上研究结果说明,尽管h Mb存在二聚体的形式,但由于Cys110远离血红素活性中心结构,因而构象没有受到明显的影响,所以其NIR催化活性也没有很大的差异。说明在低氧状态下,Mb存在稳定的NIR活性。第三部分:低氧下Mb促p BM-MSCs分化为内皮细胞的作用目的:探讨Mb在低氧状态下促进p BM-MSCs定向分化为内皮细胞中的作用及机制。方法:采用q RT-PCR、Western blot以及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）方法检测p BM-MSCs中是否存在Mb的表达。通过q RT-PCR、Western blot以及IF方法,研究Mb在常氧与低氧浓度下诱导p BM-MSCs定向分化为内皮细胞过程中的表达情况。同时采用Griess实验及NO荧光探针方法分别检测p BM-MSCs细胞培养上清及细胞内NO的变化情况,采用q RT-PCR与Western blot检测HIF-1α以及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达情况,ELISA检测细胞培养上清VEGF水平。进而采用Mb si RNA方法进一步探讨Mb在低氧状态下,促进p BM-MSCs定向分化为内皮细胞中的作用机制。结果:通过q RT-PCR,Western blot以及IF方法证实p BM-MSCs存在Mb的表达,且主要定位于p BM-MSCs的胞浆中。在常氧状态下,对p BM-MSCs向内皮细胞进行定向诱导分化10天,而后通过Western blot检测,发现在此过程中,Mb的表达没有明显变化。接下来分别在低氧以及常氧条件下培养p BM-MSCs,通过Western Blot检测结果显示在低氧组,Mb的表达随着培养时间的延长有所增高。而在低氧诱导p BM-MSCs定向分化72 h的实验中,低氧诱导组Mb的表达较常氧诱导组明显增高,在诱导分化72 h后两组的差异最为显著（P<0.01）,且呈时间依赖性。同时采用Griess实验及NO荧光探针方法分别检测p BM-MSCs细胞培养上清及细胞内NO的变化情况,通过q RT-PCR与Western blot检测HIF-1α/VEGF的表达情况,ELISA检测细胞培养上清VEGF水平。结果显示:NO的水平以及HIF-1α/VEGF在低氧诱导组的表达均较常氧组显著增高（P<0.05）,与Mb的表达情况一致。采用si RNA技术在p BM-MSCs中下调Mb基因的表达后,结果发现Mb基因沉默后,对p BM-MSCs中NO的生成有明显的抑制作用,而后HIF-1α与VEGF蛋白的表达也出现了显著的降低,而内皮细胞特异性标志物VE-Cadherin与v WF的表达也随之下降,细胞管腔样结构形成显著受到抑制。说明Mb在低氧状态促进p BM-MSCs定向分化为内皮细胞的过程中起着重要的作用。结论:1.2%低氧可以促进p BM-MSCs定向诱导分化为具有较强成管能力,且高表达内皮细胞特征性标志物VE-Cadherin与v WF的内皮样细胞。2.Mb具有高度同源性,h Mb存在二聚体与Cys110密切相关,但其并不影响血红素活性中心的结构。h Mb及其突变体C110A-h Mb结构相似,具有催化强度相近的NIR活性,均能在低氧环境下催化NO₂ˉ还原为NO。3.BM-MSCs中存在Mb的表达。2%低氧浓度下,Mb通过其NIR活性催化NO₂ˉ还原产生NO,进而通过HIF-1α/VEGF途径促进p BM-MSCs向内皮细胞定向分化。