ATP合成及纯化工艺研究

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随着酶工程、生化技术的发展,以三磷酸腺苷(ATP)为原料,采用酶促法生产医药产品,已达到产业化应用规模,ATP市场需求日益增加。目前国内市场ATP供应,基本上采用以腺苷为原料合成ATP的工艺生产。以ATP为原料进行的生物合成,均会伴生副产物二磷酸腺苷(ADP),因为国内外没有可行的ADP回收工艺路线报道,ADP基本废弃,污染环境、浪费资源。因此,寻找以ADP为原料合成ATP的工艺路线,实现ADP的循环利用,不仅有学术意义,在环境保护、降低生产成本、实现循环经济方面也具有非常重要的意义。本文以ATP为原料的生物合成副产物ADP的回收工艺出发,研究了利用啤酒酵母泥酶系,以回收ADP为原料,合成ATP工艺:摸索了ADP回收方法,并利用回收得到的ADP,对发酵反应最佳底物浓度、反应温度、发酵液pH值、发酵时间等因素对发酵反应的影响进行研究;同时对发酵液脱盐、脱色纯化、ATP纯化精制进行了系统研究,确定了可行的工艺路线。ADP的回收:采用205×7苯磺酸系阴离子交换树脂吸附,以甲酸、甲酸铵缓冲溶液系统进行洗脱,洗脱液经纳滤脱盐、低温减压浓缩至合格浓度后,直接作为ATP的发酵反应原料。为降低发酵反应生产成本,利用第三代啤酒酵母泥作为酶系统,对发酵液中的酵母泥、葡萄糖、NaH2PO4、K2HP04、(NH4)3S04、MgS04等6种因素不同浓度水平进行考察,研究其对ADP转化的影响,确定了最佳工艺配方,其结果为:m(葡萄糖)为3.5%,m(酵母泥)为6.5%,m(K2HP04)为3.4%,m(NaH2P04)为7.6%,m[(NH4)3S04]为0.2%,m(MgSO4)=1.44%。考虑发酵液成分复杂,含有大量的盐类底物及糖类,有效成分浓度低,需要经纯化处理。经研究,确定采用板框式压滤机进行酵母泥的固液分离,7号滤材,0.2MPa压力,过滤液经活性炭769-1(上海兴长)脱盐,流速:0.25BV/h,用紫外分光光度计监控,A260值≤0.1。(上样量1.5-2倍柱体积)、纯化水冲洗至2B柱体积,流速:0.25BV/h,紫外分光光度计监控,(收集流出液A260值≥0.1部分)。用50%乙醇(pH=9用氨水调节)进行洗脱,流速:0.25BV/h。洗脱液减压浓缩,温度<70℃,真空度-0.09MPa,回收乙醇。至剩体积1/3,进行大孔树脂脱色。经筛选,选择HZ-818上海华震(60-80目)大孔树脂作为脱色树脂。流速:0.5BV/h,流出液无需处理,可直接进行阴树脂分离纯化。将经大孔树脂柱流出液加入阴离子交换树脂柱中(HZ-201),先后用2B柱体积1%氢氧化钠溶液洗脱,除去核苷酸,纯化水洗脱至中性,0.05M氯化钠溶液pH值1.5,洗脱AMP、ADP,0.75M氯化钠溶液pH值3,洗脱,得到ATP。经检验,采用此工艺生产的ATP质量符合药典标准。生产工艺稳定,重现性好,成功实现了ADP成功转化。
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