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甲醇营养型巴斯德毕赤酵母最近已被越来越多的用来表达重组蛋白质。相比起哺乳动物细胞，巴斯德毕赤酵母要更容易进行基因操作和高密度培养。同样重要的是，毕赤酵母是一种真核生物，表达出来的蛋白质具有更好可溶性，能进行正确的折叠以及行使生物功能所需的翻译后修饰。本研究将巴斯德毕赤酵母表达载体pHBM905A改造成定向克隆的方式，极大的提高了克隆效率。
本研究首先在毕赤酵母表达载体pHBM905A基础上构建了基于LacO重构的定向T载体pHBMYEV。载体经IIS型限制性内切酶Bful酶切后，会在3’末端产生一个突出的碱基T。而目的基因经过PCR扩增得到的产物则会在3’末端带上一个突出的碱基A。由于载体自身带有13bp长的LacO序列，目的基因的引物上带有7bp长的片段。把载体和片段经过连接反应后转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，涂在加有底物X-gal的平板上。定向插入的克隆将重构完整的LacO序列，竞争性吸附宿主菌表达的LacI蛋白，使宿主菌本身的β-半乳糖苷酶基因表达解抑制，从而降解平板上的X-gal使得转化子显蓝色。由其它原因得到的转化菌落不能表达β-半乳糖苷酶而显白色。
另外本研究还构建了基于T7启动子重构策略的定向T载体pHBMYGFP。该载体也是使用IIS型限制性内切酶BfuI酶切而在3’末端产生一个突出的碱基T，并且自身带有9bp的T7启动子序列，而在设计目的基因引物时加上另外的7bp的序列。把酶切得到的载体和PCR得到的目标基因产物连接后转化大肠杆菌RosettaBlue感受态细胞，37℃培养一段时间。目的克隆将重构完整的T7启动子，从而表达超折叠GFP基因，重组克隆在蓝光下会发出强烈的绿色荧光，其它的转化菌落则不能发光。
以上两个载体都经过验证，使用它们克隆PCR产物会非常的有效率。