【摘 要】
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薯蓣皂素是世界上200多种甾体激素类药物的前体,其本身也被报道具有抗癌以及预防与治疗神经系统疾病等药用功效。薯蓣皂素每年市场需求超过2000吨,中国与墨西哥为世界上薯蓣皂素主要生产国。尽管薯蓣皂素在数种单子叶与双子叶植物中均有分布,但单子叶植物盾叶薯蓣为中国地区薯蓣皂素工业化生产的药源植物。上个世纪60年代末人们就已发现薯蓣皂素的合成起源于胆固醇,分别在其碳22、16与26位置发生氧化反应而形成。
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薯蓣皂素是世界上200多种甾体激素类药物的前体,其本身也被报道具有抗癌以及预防与治疗神经系统疾病等药用功效。薯蓣皂素每年市场需求超过2000吨,中国与墨西哥为世界上薯蓣皂素主要生产国。尽管薯蓣皂素在数种单子叶与双子叶植物中均有分布,但单子叶植物盾叶薯蓣为中国地区薯蓣皂素工业化生产的药源植物。上个世纪60年代末人们就已发现薯蓣皂素的合成起源于胆固醇,分别在其碳22、16与26位置发生氧化反应而形成。在时隔半个世纪的2019年,美国MIT科学家从双子叶植物葫芦巴中鉴定了胆固醇至薯蓣皂素合成的关键P450酶,然而在本课题开展之前,作为薯蓣皂素主要的工业化生产植物,单子叶植物盾叶薯蓣中薯蓣皂素合成基因尚未被分离,单双子叶植物之间薯蓣皂素的生物合成机制是否存在差异也不清楚。为回答上述科学问题,本课题选择单子叶植物盾叶薯蓣为研究材料,利用生物化学以及结构生物学等技术手段,成功解析了其中薯蓣皂素的生物合成机制,获得的大致结果概述如下:1、单子叶植物盾叶薯蓣中薯蓣皂素合成酶的鉴定围绕本实验室前期筛选的、盾叶薯蓣植物中与薯蓣皂素合成呈正相关的19种候选P450酶基因,本课题以胆固醇合成酵母RH6829为底盘菌株,依次对候选P450酶的生化功能进行鉴定分析,最终发现其中4种P450酶负责催化盾叶薯蓣植物中薯蓣皂素的合成,它们分别是CYP90B71、CYP90G6、CYP94N8或CYP94D143,其中CYP90B71与CYP90G6以胆固醇为底物,依次催化22R-与16S-羟基化反应,而CYP94N8或CYP94D143负责其中的C26-氧化反应。2、单双子叶植物薯蓣皂素合成机制的比较分析通过上述单子叶植物盾叶薯蓣中薯蓣皂素合成酶的鉴定分析研究,本课题发现22R-hydroxycholesterol以及16S,22R-dihydroxycholesterol为单子叶植物盾叶薯蓣中薯蓣皂素合成的前体或中间体,然而此发现与2019年度美国MIT科研团队报道的、双子叶植物葫芦巴中薯蓣皂素的合成途径却不相符,他们认为在葫芦巴植物中22S-hydroxycholesterol以及16S,22S-dihydroxycholesterol为薯蓣皂素合成的前体或中间体。为了探究单双子叶植物中薯蓣皂素的生物合成机制是否存在差异,本课题以WAT11酵母为表达背景菌,分别表达来自葫芦巴与盾叶薯蓣植物的薯蓣皂素合成P450酶,借助酵母微粒体开展了详尽的生化特征分析,结果发现:无论是单子叶盾叶薯蓣还是双子叶葫芦巴植物,其中的薯蓣皂素生物合成机制本质上相同,均是采用22R-hydroxycholesterol以及16S,22Rdihydroxycholesterol为中间体,而之前报道的16S,22S-dihydroxycholesterol实为薯蓣皂素合成通路的副产物。3、薯蓣皂素合成酶活性演化的结构机理解析胆固醇至薯蓣皂素合成的P450酶均隶属于CYP90家族,2019年度人们成功获得了拟南芥植物CYP90B1蛋白的晶体结构。CYP90B1为油菜素甾醇合成途径酶,这类酶以胆固醇为底物催化其C22位置的氧化反应,在植物中保守存在。本课题发现CYP90B1以胆固醇为底物,分别催化22R-与22S-羟基化反应,而22S-hydroxycholesterol为油菜素甾醇的前体。以CYP90B1晶体结构为模板,本课题模拟薯蓣皂素合成酶CYP90B71（22R-羟基化酶）以及CYP90G6（16S-羟基化酶）的蛋白结构,预测了其催化腔中的底物结合氨基酸位点;通过底物结合位点的定向突变,发现了其中专一的22R-以及16S-羟基化活性均由这些底物结合位点控制,甚至可以其它CYP90s为模板,通过定向改变这些位点即可获得薯蓣皂素合成所需的、专一的22R-与16S-羟基化活性。上述结果也许重现了自然界中薯蓣皂素合成酶的功能演化历程,比如本课题推测CYP90B71很可能是由油菜素甾醇合成途径中的CYP90s（如CYP90B1）演化而来,在进化选择过程中丧失了其22S-羟基化活性,而只保留下22R-羟基化活性,从而演化成了专一的胆固醇22R-羟化酶。
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