羟基自由基高效杀灭链状裸甲藻孢囊的研究

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赤潮藻孢囊是大规模赤潮爆发的主要原因之一,当营养物质、温度及水流条件适宜时,孢囊萌发形成赤潮藻。近些年以来,近海海洋赤潮的爆发频率越来越频繁,赤潮影响海域的面积越加广阔。有害藻类的爆发会直接危害海域环境,污染水质,造成巨大的沿海经济损失。因此有必要开展孢囊杀灭方法的研究,本文首先构建高效制备羟基自由基(Hydroxyl radical,·OH)的实验装置,然后开展·OH对链状裸甲藻孢囊的杀灭实验,而后通过萌发率确定·OH的CT阈值,通过孢囊叶绿体荧光的变化分析·OH对孢囊叶绿体的破坏,通过DAPI及HE染色分析·OH致孢囊核酸的破坏。本文研究的主要结果如下:(1)本实验各冲刷阶段作用孢囊的总氧化剂浓度(Total reactive oxidants,TRO)是4.10±0.10 mg/L,杀灭孢囊的TRO浓度稳定。冲刷前孢囊均经5 s管路作用且TRO=4.06 mg/L,·OH冲刷5 min后孢囊萌发率是61.3%,孢囊杀灭率是43.8%,·OH冲刷15min后孢囊萌发率是19.1%,杀灭率是85.1%,·OH冲刷20min后孢囊无法萌发,完全杀灭链状裸甲藻孢囊。·OH杀灭阈值是83.74 mg·min/L,较常规氧化剂如H2O2和ClO2的杀灭阈值有大幅度下降,是Vibrex?(主要成分是ClO2)杀灭阈值的1/6019,是Peraclean?Ocean(主要成分为过氧乙酸和H2O2)杀灭阈值的1/48125,是H2O2杀灭阈值的1/171960,·OH能高效杀灭链状裸甲藻孢囊,本实验为杀灭赤潮藻孢囊提供了新方法。(2)通过分析叶绿体红色荧光的改变,表征孢囊叶绿体的损伤。将孢囊置于温度是15℃和2000lx光照强度的培养箱中48h,孢囊恢复叶绿体红色荧光,以此开展·OH致孢囊叶绿体损伤的实验,杀灭孢囊的TRO=4.10±0.10 mg/L,·OH管路作用孢囊5 s并冲刷20min,孢囊失去叶绿体红色自发荧光,说明·OH已经氧化破坏孢囊叶绿体;(3)通过4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)荧光染色法和苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色法分析·OH致孢囊核酸的破坏。孢囊的DAPI荧光染色和HE染色结果—致,结果表明对照组孢囊核酸密集卷绕在细胞核内,细胞内分布着各细胞器核酸,杀灭孢囊TRO=4.10±0.10mg/L,·OH管路作用孢囊5 s并冲刷20 min,·OH破坏孢囊细胞质蛋白结构并氧化降解核酸,最终杀灭孢囊。综上所述,本文基于大气压强电离放电高效制备·OH,构建·OH高效杀灭孢囊的实验装置,实现了·OH对链状裸甲藻孢囊的杀灭。·OH氧化破坏孢囊叶绿体及细胞核核酸,孢囊无法开展光合作用,萌发过程受到抑制,且DNA的损伤无法逆转,核酸无法调控孢囊功能蛋白的合成与作用,细胞无法运转,最终导致链状裸甲藻孢囊的杀灭。
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