罐装食品中双酚A二缩水甘油醚及其衍生物免疫分析方法的建立

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双酚A二缩水甘油醚(BADGE)是一种由环氧氯丙烷(ECH)与双酚A(BPA)缩聚合成的淡黄色液态环氧化合物。它被广泛用作环氧树脂聚合的基础材料,主要用于金属罐装食品的内壁涂料,其目的是防止食品内容物与金属材料直接接触。在罐装食品的加工以及储存过程中,内壁涂料含有的单体化合物BADGE会逐步迁移至食品中,与食品接触后会发生水解或氯代反应生成BADGE·H2O、BADGE·HCl和BADGE·HCl·H2O等衍生物。这些物质通过食物链被人体摄入后,会造成人体的内分泌系统和神经系统出现异常,对健康造成不利影响。本研究以BADGE及其衍生物为检测对象,基于广谱识别多克隆抗体,分别建立了间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA)和纳米金免疫层析方法实现对罐装食品中BADGE、BADGE·HCl、BADGE·H2O和BADGE·HCl·H2O的多种残留物的检测。主要研究内容及结果如下:(1)根据BADGE、BADGE·HCl、BADGE·H2O和BADGE·HCl·H2O的特征结构设计并合成了半抗原C和半抗原F,采用碳二亚胺法(EDC)和活泼酯法(DCC)将半抗原与大分子蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原,并通过免疫新西兰大白兔得到八种抗血清。在同源和异源包被下比较八种抗血清对BADGE及其衍生物的检测灵敏度,筛选出两种抗血清进行亲和层析纯化获得多克隆抗体PAb-1和PAb-2,其浓度分别为2.17和1.94 mg/m L,并基于这两种抗体建立间接竞争ELISA方法检测BADGE及其衍生物。(2)通过建立间接竞争ELISA方法实现对罐装午餐肉中BADGE及其衍生物的检测,分析了同源包被和异源包被对方法灵敏度的影响,并对实验参数进行了优化。确定最佳实验条件为:PAb-1采用包被抗原为DCC-F-OVA,浓度为0.375μg/m L,抗体稀释400倍;PAb-2采用EDC-C-OVA为包被抗原,浓度为1.5μg/m L,抗体稀释200倍;HRP酶标二抗稀释20000倍用于检测BADGE和BADGE·HCl·H2O,稀释40000倍用于检测BADGE·H2O和BADGE·HCl;封闭液为3%脱脂奶粉/PBS。在最佳实验条件下,间接竞争ELISA方法检测BADGE、BADGE·HCl、BADGE·H2O和BADGE·HCl·H2O的灵敏度(IC50)分别为16.48、20.21、14.46、33.76 ng/m L,检测限(IC15)分别为0.73、0.78、0.39、1.45 ng/m L。将所建立的方法应用于罐装午餐肉的检测中,通过加标回收实验测得的回收率范围在76.70~102.85%。采用高效液相色谱法(HPLC)进行同步验证,得到了较高的相关性(R~2=0.9839)。选择午餐肉罐头、黄桃罐头和红牛饮料分别代表动物源、植物源和饮料类三种不同类型的罐装食品,研究储存时间以及储存温度对这三种罐装食品中BADGE及其衍生物迁移量的影响,并利用建立的ELISA方法对罐装食品中BADGE及其衍生物的迁移总量进行检测,实验结果表明三种罐装食品中的BADGE及其衍生物的总量随着时间和温度的增加呈现递增的趋势,且ELISA的测定结果与HPLC检测结果具有较高的一致性。(3)采用柠檬酸三钠还原法合成了金纳米颗粒(Au NPs),将Au NPs与广谱识别效果较佳的抗体PAb-2标记作为免疫检测探针,对标记过程的p H值、抗体标记量、T区包被原浓度以及探针添加量进行优化。在最优条件下建立Au NPs-PAb免疫层析分析方法用于检测罐装食品中BADGE、BADGE·HCl、BADGE·H2O和BADGE·HCl·H2O四种化合物总量,并借助计算机软件实现定量分析,得到方法检出限为1 ng/m L。该方法同时用于午餐肉、黄桃罐头以及红牛饮料三种罐装食品的加标回收实验,回收率范围为87.35~100.43%,与HPLC测定的结果相关性达到R~2=0.9792。
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