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随着近年研究的深入,咽喉反流(laryngopharyngeal reflux,LPR)作为一种协同因素参与声带白斑及喉癌的发生发展已经逐步成为一个共识。而声带白斑术后复发也是临床上常见且比较难以解决的问题,如何降低声带白斑的手术复发率成为临床关注的热点和重点。声带黏膜上皮为复层鳞状上皮,声带黏膜屏障的完整性是维持声带基本形态及功能的基础。研究表明,声带白斑的黏膜屏障存在结构和功能的异常可能是声带白斑复发和进展的重要原因,而咽喉反流可导致或加重黏膜屏障的破坏。据此,我们假设:通过抑酸治疗咽喉反流可能降低声带白斑术后复发率,其作用机制是保护声带黏膜上皮屏障的完整性。慢性炎症反应在声带白斑和喉癌的发生和发展的过程中起到极其重要的作用,涉及复杂的细胞信号传导网络,其中NF-κB通路发挥着关键作用,它是介导机体内炎症反应的一条重要信号通路。但NF-κB及其调控的信号通路的激活是否参与声带白斑的发生和发展目前尚不完全清楚。因此,本课题拟通过抑酸治疗对声带白斑术后复发影响的研究,明确抑酸治疗影响声带白斑复发的重要意义,并探讨抑酸治疗对声带黏膜屏障的作用及可能机制,为深入了解LPR在声带白斑发生和发展中的作用,改善声带白斑术后复发率提供理论依据和新的思路。全文共分两个大部分共三个研究进行临床和基础研究。第一部分抑酸治疗对声带白斑术后复发的影响目的通过观察LPR对声带黏膜白斑转归的影响,探讨咽喉反流在声带白斑发病和进展中的作用,明确抑酸治疗在声带白斑治疗中的作用。方法根据24h测酸结果将声带白斑患者分为LPR组(n=26)和非LPR组(n=71),并将LPR组患者分成质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPIs)治疗组和未治疗组。所有患者分别于术前和术后8周记录电子喉镜、嗓音障碍指数-10量表(VHI-10)、反流症状指数量表(RSI)以及体征指数量表(RFS)量表结果并比较。所有患者每月定期复查,随访时间至少为12个月。随访期间若可疑局部有复发,记录发现可疑复发的时间,活检并记录最新病理诊断,按首次病理级别记录声带白斑进展的情况。结果反流组和非反流组术前RSI、RFS、VHI-10三项指数均值差异有统计学意义(P<0.05)。反流组和非反流组术后RSI(t=1.9742,P<0.05)和RFS(t=2.4289,P<0.05)两项指数均值差异有统计学意义,VHI-10指数均值差异无统计学意义(t=1.3094,P>0.05)。反流组术前和术后RSI(t=1.9742,P<0.05)和RFS(t=2.4318,P<0.05)两项指数均值差异有统计学意义,VHI-10指数(t=1.3384,P>0.05)均值差异无统计学意义。非反流组术前和术后RSI(t=1.7472,P<0.05),和RFS(t=2.4318,P<0.05)两项指数均值差异有统计学意义,VHI-10指数均值VHI-10(t=0.5055,P>0.05)差异无统计学意义。治疗组PPI治疗前与PPI治疗8周后RSI、RFS、VHI-10结果比较:RSI(t=2.734,P<0.05),RFS(t=5.069,P<0.05),VHI-10(t=2.303,P<0.05),RSI、RFS和VHI-10三项指数均值差异有统计学意义。反流组中治疗组24例中14例复发,未治疗组2例均复发,累计复发率分别为58.3%和100%,但两组累计复发率差别无统计学意义。结论伴有LPR的声带白斑患者,给予规范的PPI治疗,可以减轻咽喉反流的症状,并有效地改善声音嘶哑,同时能够降低声带白斑的复发率。第二部分抑酸治疗对声带白斑术后声带黏膜屏障的保护作用目的通过观察LPR患者抑酸治疗后对声带黏膜屏障结构和功能的影响,探讨抑酸治疗对声带白斑术后声带黏膜屏障的保护作用。方法将确诊伴有LPR的声带白斑患者知情同意后给予PPI治疗(共24例),分别采集可疑复发患者(共14例)治疗前及PPI治疗8周后的声带黏膜标本,分别进行HE染色观察组织病理学变化、透射电镜检测声带黏膜紧密连接的形态学、Western blot法检测紧密连接蛋白claudin 1、ZO-1蛋白的表达、免疫荧光法检测紧密连接蛋白位置的改变以及TUNEL法进行声带组织标本细胞凋亡的检测。结果HE染色发现治疗后组声带黏膜炎症细胞浸润明显减少,上皮结构完整性明显改善;电镜观察到治疗后组紧密连接附近的电子致密物质明显增多,紧密连接形态学明显改善。与治疗前组相比,治疗后组Claudin-1和ZO-1两种蛋白的表达量增多(P<0.05)。利用免疫荧光检测发现与治疗前组相比,治疗后组的紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1在细胞浆内表达明显增多(P<0.05)。TUNEL染色法检测示,与治疗后组相比,治疗前上皮细胞凋亡数量明显增多(P<0.05)。结论咽喉反流可导致紧密连接结构破坏,表现为相关蛋白功能表达异常,细胞间连接遭到破坏,细胞间隙扩大,声带黏膜上皮的通透性增高。而抑酸治疗则可以保护和恢复声带黏膜屏障的完整性。第三部分抑酸治疗改善声带白斑术后声带黏膜炎症的可能机制目的通过观察声带黏膜相关炎症因子及NF-κB信号通路节点关键蛋白的表达,探讨NF-κB信号通路调控声带黏膜屏障损伤的机制。方法确诊伴有LPR的声带白斑患者(共24例)给予PPI治疗,采集可疑复发患者(共14例)手术时声带黏膜标本及PPI治疗8周后的声带黏膜标本。用HE染色对声带炎症的病理改变进行评分比较;ELISA法检测声带组织细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平;Western blot法测定p-P65,p-IKK,p-IκB蛋白表达水平;免疫荧光检查确定粘膜上皮细胞内P65有无磷酸化激活并入核,以及Q-PCR法检测声带组织TNF-α、IL-1β、IL-6的基因转录水平。结果HE染色PPI治疗后组声带黏膜炎症评分显著低于PPI治疗前组(t=4.818,P<0.05);PPI治疗组后中IL-1β(t=5.16,P<0.05)、TNF-α(t=8.944,P<0.05)、IL-6(t=t=9.383,P<0.05)表达较治疗前组显著下调表达显著下调。PPI治疗后组P65蛋白表达水平较治疗前组无明显差异,治疗后组p-P65水平较治疗前组明显降低(P<0.05)。IL-1β、TNF-α、IL-6表达与p-p65表达之间成正相关,与p-IκB表达成负相关。免疫荧光结果显示治疗前组p-P65蛋白进入细胞核内,NF-κB处于激活状态,而治疗后组细胞核内未见活化的p-P65蛋白。与治疗前组相比,治疗后组IL-1β(t=8.211,P<0.05)、IL-6(t=15.36,P<0.05)、TNF-α(t=20.19,P<0.05)三种因子的基因相对表达量显著降低。结论咽喉反流激活NF-κB及其调控的信号通路所介导声带黏膜的炎症反应可能是黏膜屏障损伤的机制。