论文部分内容阅读
目 的1.人体前列腺癌和前列腺增生组织中Engrailed-2基因mRNA的表达2.Engrailed-2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定3.人体前列腺癌和前列腺增生组织中Engrailed-2蛋白的表达方 法分别收集临床病理确诊的前列腺癌组织标本20例,前列腺增生组织标本25例,使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR）检测人体前列腺癌和前列腺增生组织标本中Engrailed-2基因mRNA的表达。将Homeobox Engrailed-2基因（NM001427.3）C末端114aa序列连接到基因表达载体pET-28a,转染大肠杆菌,表达纯化EN2重组蛋白。用该EN2重组蛋白免疫小鼠,使用杂交瘤技术筛选表达EN2单克隆抗体的细胞株,使用ELISA、Western Blotting、免疫组化等方法鉴定抗体性质,将阳性细胞株接种到小鼠腹腔进行EN2单克隆抗体的大量制备。随后,使用EN2单克隆抗体对人体前列腺癌和前列腺增生组织进行免疫组化,分析EN2蛋白在人体前列腺癌组织和前列腺增生组织中的表达差异。结 果20例人体前列腺癌组织中EN2基因的mRNA表达均高于良性前列腺增生组,相对于良性前列腺增生组,前列腺癌中EN2基因的表达最低为1.45倍,最高为31.42倍。成功构建pET-28a-EN2重组表达载体,转染大肠杆菌后,诱导表达大小约25kD的EN2重组蛋白,用其免疫4只BALB/c小鼠,其中3只小鼠的血清效价较高,能达到1:3.2×104-1:6.4×104。将这3只小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经过两轮ELISA筛选,最终筛选出5B7、7E11、31D6、32E7、33H5、18H10、34E9、37C3,共8株能产生针对EN2重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将其扩大培养,分别接种到BALB/c小鼠的腹腔,收集腹水后,使用Protein G亲和层析柱纯化小鼠腹水,最终得到8株EN2蛋白的单克隆抗体,分别为 5B7（0.584mg/ml）、7E11（0.263mg/ml）、31D6（0.291mg/ml）、32E7（0.468mg/ml）、33H5（0.502mg/ml）、18H10（0.105mg/ml）、34E9（1.831mg/ml）、37C3（0.165mg/ml）。8 株 EN2 单抗纯化后,SDS-PAGE 电泳均能在 50kD 和 25kD处见清晰条带,分别对应抗体的重链和轻链。经过效价测定,这8株EN2单抗中5B7和37C3的抗体效价较高,均能达到1:1.28×104以上,用于后续实验。经Western Blot检测,这两株EN2单抗可以与EN2重组蛋白特异性结合,在靠近25kD处可见清晰条带,与重组EN2蛋白的大小一致。另外,这两株EN2单抗,可以与3种前列腺癌细胞系LNCap、PC3、DU145的细胞总蛋白中的EN2蛋白特异性结合,显影条带在34kD左右,符合EN2完整蛋白的大小,并且LNCap细胞系中EN2蛋白表达较高。用该EN2单克隆抗体在人体前列腺癌和前列腺增生组织中进行免疫组化检测,结果显示前列腺癌组织中EN2蛋白呈阳性,而前列腺增生组织中EN2蛋白为阴性,且EN2基因表达高的组织,比如组织1和6,EN2蛋白的表达也较高。结 论在所收集的样本中,前列腺癌组织中EN2基因的表达均高于前列腺增生组,从1.45倍到31.42倍不等。成功制备EN2小鼠单克隆抗体。使用自制抗体进行实验,发现LNCap细胞系中EN2蛋白表达较高。而人体前列腺癌组织中EN2蛋白的表达明显高于前列腺增生组织。且EN2基因表达高的组织,EN2蛋白的表达也较高。