目的运用代谢组学方法研究茵陈蒿汤主要血中移行成分6,7-二甲氧基香豆素对酒精诱导小鼠原代肝细胞损伤的保护作用,从细胞代谢角度探索6,7-二甲氧基香豆素对酒精致损伤的小鼠原代肝细胞代谢的影响及相关效应机制;发现有助于揭示酒精致肝损伤的病理机制及6,7-二甲氧基香豆素治疗酒精性肝病的效应关键靶标,为治疗酒精性肝病的药物发现提供新靶点。方法采用两步灌流法建立酒精诱导小鼠原代肝细胞损伤模型,应用MTT法检测细胞成活率,荧光染色技术评价6,7-二甲氧基香豆素对酒精损伤原代肝细胞的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。基于细胞代谢组学的理论和方法,应用超高效液相色谱串联四级杆/飞行时间高清质谱(UPLC-SYNAPT-G2-Si-HDMS)技术及多变量模式识别分析原代肝细胞(胞内,代谢指纹)及其培养液(胞外,代谢足迹)中代谢物的组成及代谢差异,应用Markerlynx以及EZinfo 2.0软件进行代谢数据的模式识别方法,诸如主成分分析(PCA),偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),通过变量重要性投影(VIP)选取潜在的生物标志物,结合质谱碎片信息和数据库检索对潜在生物标志物进行结构鉴定,将潜在生物标志物输入KEGG公共数据库中构建代谢通路网络。利用改进的’MetPA识别显著富集通路’方法聚焦发现6,7-二甲氧雄香豆素保护原代肝细胞损伤的代谢途径。进一步用定量ELISA及PCR方法确定重要代谢通路中关键调节酶的变化。结果1.小鼠原代肝细胞酒精损伤的模型建立与评价采用经典的胶原酶两步灌流法持续获得了高活力及稳定的小鼠原代肝细胞。MTT法检测表明酒精致原代肝细胞存活率明显降低,且作用呈剂量依赖性。进一步研究发现当酒精处理原代肝细胞后大部分细胞发生凋亡,形态出现明显改变,表现为细胞变小、细胞表面皱缩、细胞核聚缩、有凋亡小体形成等,同时伴心坏死产生。流式细胞仪分析结果证实酒精损伤肝细胞主要集中在早期凋亡阶段,出现Sub-GO/G1峰,凋亡产生DNA链断裂碎片。2.基于代谢组学技术的酒精诱导小鼠原代肝细胞损伤特征研究首先建立小鼠原代肝细胞样品的UPLC-SYNAPT-G2-Si-HDMS分析方法。利用已建立方法分析酒精性肝损伤细胞代谢轮廓,发现组内聚类较好,且显示出良好的组间区分性,共鉴定出酒精性肝细胞损伤模型的19个特异性代谢标记物。与正常组比较,模型组中的吲哚(indole),4-羟基苯甲醛(4-hy droxybenzaldehyde),L-亮氨酸(L-leucine),2-苯乙酰胺(2-phenylacetamide),苯丙酮酸(phenylpyruvic acid),喹哪啶酸(quinaldic acid),5-羟乙醛(5-hydroxyindoleacetaldehyde),L-酪氨酸(L-tyrosine),吲哚乙酸(indoleacrylic acid),s-(2-甲基丁酰基)-二氢硫辛酰胺(s-(2-methylbutanoyl)-dihydrolipoamide),lysoPC(14:1(9Z)),乳醛(lactaldehyde),L-乳酸(L-lacticacid),琥珀酸(succinic acid),二氢胸腺嘧啶(dihydrothymine),6-羟基己酸(6-hydroxyhexanoic acid),N-琥珀酰-L,L-2,6-二氨基庚二酸(N-succinyl-L,L-2,6-diaminopimelate),二十碳二烯酸(eicosadienoicacid)表现为上调的趋势,1-苯乙胺(1-phenylethylamine)表现为下调的趋势。这些代谢标志物主要与(1)苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成,(2)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,(3)苯丙氨酸代谢,(4)酪氨酸代谢通路相关。3.基于细胞生物学及代谢指纹技术的6,7-二甲氧基香豆素对酒精致原代肝细胞的保护作用采用形态学观察和荧光染色技术发现经6,7-二甲氧基香豆素干预后,大多数细胞生长状态良好,结构清晰,贴壁状态呈延伸状,改善细胞凋亡和坏死情况。流式细胞仪检测结果发现6,7二甲氧基香豆素干预后G1峰较模型组有所升高,二倍体亚峰降低,说明6,7二甲氧基香豆素有抑制酒精致原代肝细胞凋亡并阻止DNA链断裂的作用。在此基础上,评价了 6,7-二甲氧基香豆素对酒精诱导原代肝细胞的保护作用。采用非监督性的多维分析方法对6,7-二甲氧基香豆素作用酒精肝细胞2h、4h、8h、12h、24h的代谢样本进行分析,从主成分分析(PCA)得分图中可以观察到整体代谢轮廓逐步偏离损伤的病理状态;采用多变量数据中心点距离分析整体代谢轮廓发现6,7-二甲氧基香豆素干预后肝细胞代谢物谱发生了明显变化,异常代谢轮廓明显地向正常状态转归,具有显著改善酒精诱导肝细胞损伤作用。在代谢标记物层面,发现6,7-二甲氧基香豆素对发现的19个酒精性肝损伤潜在生物标志物均有回调作用;同时,基于所筛选出的19个标记物数据建立了相应的PCA模型,三组样本在主成分1(Component 1)维度能明显的区分开,给药组中心点位于正常组和模型组之间,说明6,7-二甲氧基香豆素对酒精诱导小鼠原代肝细胞损伤有一定保护作用。采用改进的’MetPA识别显著富集通路’的方法,发现6,7-二甲氧基香豆素的抗肝细胞损伤药效作用的代谢指纹通路主要与(1)苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成,(2)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,(3)苯丙氨酸代谢及(4)酪氨酸代谢通路相关。4.基于代谢足迹分析技术的6,7-二甲氧基香豆素对酒精诱导原代肝细胞损伤作用利用UPLC-G2-Si-HDMS/MS技术对酒精诱导原代肝细胞损伤代谢足迹进行分析。实验过程中收集酒精诱导细胞第2h、4h、8h、12h、24h的培养液,经过主成分分析(PCA)发现,随着6,7-二甲氧基香豆素作用时间变化,小分子代谢谱有明显差异。与用药前Oh相比,第2h开始代谢谱表现出明显变化,至第24h不仅与给药前差异显著,也与给药后2h有显著差别,呈现明显远离Oh肝细胞病理状态的动态变化过程。经数据分析,共筛选并鉴定了 12个与酒精致肝细胞损伤相关的差异代谢物。与正常组比较,模型组中的精氨酰-天冬酰胺(arginyl-Asparagine),棕榈酰胺(palmitic amide),十八烷(octadecanamide),琥珀酸(succinic acid)表现为上调的趋势:烯醇-苯丙酮酸(enol-phenylpyruvate),2-O-对香豆羟基柠檬酸(2-O-p-coumaroylhydroxycitricacid),二十碳二烯酸(eicosadienoic acid),油酸酰胺(oleamide),4-羟苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvic acid),L-苯丙氨酸(L-phenylalanine),L-谷氨酰胺(L-glutamine),L-异亮氨酸(L-isoleucine)表现为下调的趋势。研究发现这些代谢物与(1)泛醌等萜醌生物合成(ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis),(2)苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis),(3)苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism),(4)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine,leucine and isoleucine biosynthesis),(5)丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine,aspartate and glutamate metabolism)通路相关。采用非监督主成分分析(PCA)和多变量数据中心点距离分析代谢足迹轮廓,发现6,7-二甲氧基香豆素具有调节紊乱代谢轮廓向正常状态转归的作用。利用所筛选出的12个代谢足迹差异代谢物,对6,7-二甲氧基香豆素对酒精肝细胞损伤的保护作用进行评价,发现6,7-二甲氧基香豆素能不同程度调节10个异常代谢物的水平向正常状态转归,即主要通过下调精氨酰-天冬酰胺(arginyl-asparagine),棕榈酰胺(palmitic amide),十八烷(octadecanamide),并使烯醇-苯内酮酸(enol-phenylpyruvate),二十碳二烯酸(eicosadienoic acid),油酸酰胺(oleamidc),4-羟苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvic acid),L-苯丙氨酸(L-phenylalanine),L-谷氨酰胺(L-glutamine),L-异亮氨酸(L-isoleucine)上调,使紊乱的代谢物得以改善。代谢足迹通路分析发现6,7-二甲氧基香豆素的抗肝损伤药效作用的靶标代谢途径主要是(1)苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)、(2)苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)、(3)泛醌等萜醌生物合成(ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis)、(4)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine,leucine and isoleucine biosynthesis)、(5)丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine,aspartate and glutamate metabolism)。5.代谢指纹及代谢足迹数据整合分析由于胞内与其胞外培养液有代谢物的交换,将细胞内代谢物指纹与细胞外代谢足迹联合分析,使细胞代谢组学分析更完整。将细胞内代谢指纹及19个生物标志物与代谢足迹及12个差异代谢物输入MetPA平台构建整合代谢通路,鉴别酒精诱导的原代肝细胞损伤主要与(1)苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)、(2)泛醌等萜醌生物合成(ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis)、(3)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine,leucine and isoleucine biosynthesis)、(4)苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)、(5)酪氨酸代谢(Tyrosine metabolism)、(6)丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine,aspartate and glutamate metabolism)等代谢途径相关。利用MetPA识别显著富集通路’方法分析6,7-二甲氧基香豆素保护肝细胞损伤的药效相关通路,主要是(1)苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)、(2)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine,leucine and isoleucine biosynthesis)、(3)苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism),并结合代谢物显著性变化趋势,构建6,7-二甲氧基香豆素调节肝细胞损伤的网络示意图,聚焦发现以苯丙氨酸代谢通路最为重要。采用皮尔逊相关分析法将细胞内和细胞外差异代谢物进行相关分析以探索这些重要代谢物之间的内在关联,发现L-酪氨酸(L-tyrosine)、2-苯乙酰胺(2-phenylacetamide)与细胞外差异代谢物呈强烈正相关(r>0.80),ELISA方法发现6,7-二甲氧基香豆素主要通过调节苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)途径中代谢酶酶活性来阻滞酒精导致的肝细胞损伤,提示苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸转氨酶及氨基酸氧化酶可能作为治疗酒精肝的重要靶标,阻断或修饰异常的苯丙氨酸代谢通路对于治疗酒精肝具有潜在的应用价值。结论本研究发现了酒精损伤性原代肝细胞的主要标记物是吲哚(indole),4-羟基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde),L-亮氨酸(L-leucine),2-苯乙酰胺(2-phenylacetamide),苯丙酮酸(phenylpyruvic acid),喹哪啶酸(quinaldic acid),5-羟乙醛(5-hydroxyindoleacetaldehyde),L-酪氨酸(L-tyrosine),吲哚乙酸(indoleacrylic acid),s-(2-甲基 丁酰基)-二氢硫辛酰胺(s-(2-methylbutanoyl)-dihydrolipoamide),lysoPC(14:1(9Z)),乳醛(lactaldehyde),L-乳酸(L-lactic acid),琥珀酸(succinic acid),二氢胸腺嘧啶(dihydrothymine),6-羟基己酸(6-hydroxyhexanoic acid),N-琥珀酰-L,L-2,6-二氨基庚二酸(N-succinyl-L,L-2,6-diaminopimelate),二十碳二烯酸(eicosadienoic acid),1-苯乙胺(1-phenylethylamine);精氨酰-天冬酰胺(arginyl-Asparagine),棕榈酰胺(palmitic amide),十八烷(octadecanamide),琥珀酸(succinicacid)表现为上调的趋势:烯醇-苯丙酮酸(enol-phenylpyruvate),2-0-对香豆羟基柠檬酸(2-O-p-coumaroylhydroxycitric acid),二十碳二烯酸(eicosadienoic acid),油酸酰胺(oleamide),4-羟苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvicacid),L-苯丙氨酸(L-phenylalanine),L-谷氨酰胺(L-glutamine),L-异亮氨酸(L-isoleucine),主要涉及苯丙氨酸代谢(phenylalaninemetabolism)、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine,leucine and isoleucine biosynthesis)代谢径路及关键代谢酶,而6,7-二甲氧基香豆素对酒精诱导原代肝细胞的损伤产生的代谢改变具有显著地干预作用。首次发现6,7-二甲氧基香豆素对酒精诱导原代肝细胞损伤保护作用与调整苯丙氨酸代谢异常具有密切相关性,通过调整苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸羟化酶、氨基酸氧化酶及酪氨酸转氨酶的活性,从而影响肝细胞的代谢途径来抑制细胞损伤。研究认为6,7-二甲氧基香豆素有开发成临床抗酒精肝药物的前景,而苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)通路有望成为酒精性肝病治疗药物筛选的新靶点。