研究背景:近年来,男性不育问题受到全球关注,严重影响人类生育质量,拟除虫菊酯（Ⅱ型拟除虫菊酯）作为公认的环境内分泌干扰物可能威胁雄性生殖健康。但目前关于氟氯氰菊酯暴露与人类及哺乳动物睾丸功能损伤等的相关研究较少,由于氧化应激与雄性不育密切相关,可能是睾丸损伤的始动因素和关键环节,那么寻找氟氯氰菊酯致睾丸损伤的过程中参与氧化应激的关键基因,将为后续氟氯氰菊酯雄性生殖损伤的研究提供新思路。G3BP1是应激颗粒形成和功能的重要调节因子,应激颗粒的形成可以防止应激诱导的细胞损伤和死亡。但目前该基因对氟氯氰菊酯诱导的睾丸损伤的发生研究较少,具体分子机制尚不清楚。因此,本课题通过建立氟氯氰菊酯诱导的睾丸及生精细胞毒性发生的体内、外模型,探讨G3BP1基因介导的P38 MAPK/JNK通路在氟氯氰菊酯致睾丸及生精细胞损伤过程中的作用及机制,为睾丸损伤的发生寻找早期、敏感指标及治疗新靶点。研究目的:通过建立氟氯氰菊酯致雄性大鼠睾丸损伤体内模型及氟氯氰菊酯染毒致GC-2精母细胞损伤体外模型,探讨G3BP1基因和P38 MAPK/JNK通路在氟氯氰菊酯致雄性生殖功能损伤中的作用机制。为雄性生殖损伤发生发展的早期、敏感指标及治疗寻找新的靶点,同时为雄性生殖系统疾病的防治提供全新思路。研究方法:1.建立氟氯氰菊酯致雄性Wistar大鼠睾丸损伤体内模型及氟氯氰菊酯染毒致GC-2精母细胞损伤体外模型1.1建立氟氯氰菊酯致雄性Wistar大鼠睾丸损伤体内模型（1）体内损伤模型建立首先选择SPF级雄性Wistar大鼠40只（260g左右）,分为对照组（玉米油）、低剂量染毒组6.25mg/kg、中剂量染毒组12.5mg/kg、高剂量染毒组25mg/kg。隔天染毒28天后麻醉处死大鼠。（2）观察氟氯氰菊酯对大鼠睾丸病理学、超微结构改变首先每天对染毒大鼠的体重进行监测,观察染毒大鼠的体重是否有变化,并观察氟氯氰菊酯对大鼠睾丸脏器系数的影响;采用HE染色及透射电镜拍摄观察氟氯氰菊酯致睾丸各级生殖细胞的形态及超微结构的病理损伤变化。（3）检测氟氯氰菊酯对雄性生殖激素水平的改变利用Elisa试剂盒对染毒大鼠血清中促性腺激素释放激素、睾酮、血清促卵泡雌激素、促黄体生成素进行检测,检测氟氯氰菊酯对大鼠雄性激素水平的影响。（4）检测氟氯氰菊酯对睾丸氧化应激损伤情况及应激颗粒关键因子G3BP1表达情况利用SOD、T-AOC、MDA试剂盒对氟氯氰菊酯染毒大鼠后睾丸中的氧化和抗氧化水平进行评价;利用LDH试剂盒对氟氯氰菊酯染毒大鼠后睾丸中的LDH的表达水平进行评价;根据睾丸氧化应激水平的变化,接着采用q-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光法检测氟氯氰菊酯染毒大鼠后对G3BP1基因表达的影响。（5）检测氟氯氰菊酯对睾丸炎症水平及ATP变化利用ATP试剂盒对氟氯氰菊酯染毒大鼠后睾丸中的ATP的表达水平进行评价。利用Elisa试剂盒对染毒大鼠血清中炎症因子TNF-α,IL-6含量进行检测,检测氟氯氰菊酯是否能引起炎症反应的发生。1.2建立氟氯氰菊酯染毒致GC-2精母细胞损伤体外模型（1）建立体外模型选用GC-2精母细胞作为研究对象,分为4组,对照组、低剂量染毒组（50μg/m L）,中剂量染毒组（100μg/m L）,高剂量染毒组（200μg/m L）,染毒时间为48h。（2）检测氟氯氰菊酯对GC-2精母细胞功能的影响采用CCK8法及划痕实验鉴定氟氯氰菊酯对细胞活力及迁移能力的影响。利用LDH试剂盒对氟氯氰菊酯染毒后精母细胞中的LDH的表达水平进行检测,评价其细胞毒性作用。（3）检测氟氯氰菊酯对GC-2精母细胞氧化应激损伤情况及应激颗粒关键因子G3BP1表达情况采用q-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光法检测氟氯氰菊酯染毒后精母细胞中G3BP1基因表达的变化。利用流式细胞术对氟氯氰菊酯染毒后精母细胞中ROS含量的变化,利用SOD、T-AOC、MDA试剂盒对氟氯氰菊酯染毒后精母细胞中的氧化和抗氧化水平进行评价。（4）检测氟氯氰菊酯对GC-2精母细胞炎症水平及ATP水平的改变利用q-PCR、Western blot对细胞中炎症因子TNF-α,IL-6含量进行检测,并对ATP的表达水平进行评价,评估线粒体损伤情况。1.3检测氟氯氰菊酯染毒致大鼠睾丸损伤体内模型、GC-2精母细胞损伤体外模型中MAPK通路关键因子的表达变化在前期体内、外模型中对G3BP1基因的含量进行检测的基础上,进一步采用q-PCR、Western blot对MAPK通路关键因子及其磷酸化蛋白,线粒体呼吸链酶复合物（COX1,COX4）,凋亡因子（Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9）的m RNA及蛋白相对表达水平变化进行检测,并采用TUNEL法检测氟氯氰菊酯致精母细胞凋亡情况,进一步阐明G3BP1基因与P38 MAPK/JNK通路在氟氯氰菊酯染毒致雄性生殖毒性中的作用,及其可引起的级联反应。1.4干预G3BP1基因的表达后观察其在氟氯氰菊酯致GC-2精母细胞损伤模型中的作用（1）建立抑制G3BP1表达及G3BP1过表达慢病毒载体为了进一步明确G3BP1基因及P38 MAPK/JNK通路在氟氯氰菊酯引起雄性生殖毒性中的作用,通过慢病毒转染构建抑制和过表达G3BP1基因的GC-2精母细胞雄性生殖损伤模型。通过嘌呤霉素药筛、荧光显微镜下观察以及WB和q-PCR检测G3BP1基因在m RNA和蛋白水平上的表达,确定G3BP1基因过表达及抑制表达细胞模型是否成功建立。（2）检测G3BP1过表达及抑制表达后氟氯氰菊酯对GC-2精母细胞功能的影响利用CCK8法检测过表达及抑制表达G3BP1基因后细胞损伤、活力的改变;利用LDH试剂盒对过表达及抑制表达G3BP1基因后精母细胞中的LDH的表达水平的改变进行检测。（3）检测G3BP1过表达及抑制表达后氟氯氰菊酯对GC-2精母细胞氧化应激水平的影响利用SOD、T-AOC、MDA试剂盒对过表达及抑制表达G3BP1基因后细胞中的氧化和抗氧化水平状态的改变进行检测;采用红色荧光检测试剂盒检测过表达及抑制表达G3BP1基因后精母细胞中ROS相应的变化情况。（4）检测G3BP1过表达及抑制表达后氟氯氰菊酯对GC-2精母细胞炎症水平及ATP的影响采用ATP检测试剂盒对过表达及抑制表达G3BP1基因后染毒精母细胞的ATP含量的变化,采用q-PCR、Western blot检测炎症因子TNF-α,IL-6含量进行检测,评估其对炎症水平及线粒体的影响。（5）检测G3BP1过表达及抑制表达后氟氯氰菊酯对GC-2精母细胞MAPK通路关键因子表达的影响进一步采用q-PCR、Western blot检测过表达及抑制表达G3BP1基因后染毒精母细胞中MAPK通路关键因子及其磷酸化蛋白、线粒体呼吸链酶复合物、凋亡因子的m RNA及蛋白相对表达水平的变化,探究调控G3BP1基因表达后,对MAPK通路的影响及其可能引起的级联反应的改变。研究结果:1.建立氟氯氰菊酯致雄性Wistar大鼠睾丸损伤体内模型及氟氯氰菊酯染毒致GC-2精母细胞损伤体外模型1.1成功建立氟氯氰菊酯致Wistar雄性大鼠睾丸损伤体内模型（1）氟氯氰菊酯可引起睾丸病理及超微结构改变建立氟氯氰菊酯致大鼠睾丸损伤的模型,首先通过HE染色观察病理改变,结果显示随着染毒剂量的增加,细胞层数逐渐变少,精曲小管形态发生变异,管腔内细胞逐渐松散,腔内空泡化,精子密度变少,精子形态不完整。透射电镜结果显示随着染毒剂量的增加,精母细胞水肿加重,细胞膜局部出现破损,线粒体嵴出现断裂和消失,脂滴数量增多,表明随着染毒剂量的增加,细胞损伤逐渐加重。（2）氟氯氰菊酯可引起大鼠高促性性腺功能障碍对雄性生殖激素进行检测的结果显示,随着染毒剂量的增加,血清Gn RH,FSH,LH水平均升高,T含量水平呈剂量依赖性降低,T/LH呈明显降低趋势,表明氟氯氰菊酯可干扰下丘脑-垂体-性腺轴的正常分泌,并且可造成高促性性腺功能障碍。（3）氟氯氰菊酯可抑制G3BP1的表达并且引起睾丸组织发生氧化应激及炎症反应对睾丸组织氧化应激水平检测结果显示,LDH,MDA呈剂量依赖性增高,SOD、T-AOC、ATP呈剂量依赖性降低;血清炎症因子IL-6、TNF-α均随着染毒剂量的增加而增高,表明机体内发生炎症反应,并且氧化-抗氧化稳态平衡被打破。当胞内氧化抗氧化稳态失衡,作为应激颗粒形成和功能的重要调节因子,G3BP1的表达会发生怎么的变化呢?Western blot、q-PCR、免疫荧光及组化结果结果显示,G3BP1的相对m RNA及蛋白表达量随染毒剂量的增加而降低,G3BP1阳性表达主要位于睾丸生精上皮和生精细胞层。1.2成功建立氟氯氰菊酯所致的GC-2精母细胞损伤体外模型（1）氟氯氰菊酯可导致GC-2精母细胞形态、活力、迁移能力改变在氟氯氰菊酯致精母细胞损伤模型中,首先通过CCK8检测氟氯氰菊酯对细胞活力的影响,结果显示随着染毒浓度的增加,细胞存活率明显下降。进一步观察发现随着染毒剂量的增加细胞形态发生变异,逐渐变圆且触角变短,而高剂量组中活细胞数量明显减少,细胞形态变异严重。同时,随着染毒剂量的增加,细胞迁移率明显降低,LDH含量逐渐增加,进一步引起细胞膜损伤,并影响细胞活力及功能。（2）氟氯氰菊酯可破坏GC-2精母细胞氧化-抗氧化系统,抑制G3BP1的表达随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加可导致GC-2精母细胞中MDA、ROS含量逐渐增加,而SOD、T-AOC、ATP呈剂量依赖性降低。以上结果表明氟氯氰菊酯可以导致精母细胞氧化-抗氧化系统的破坏导致氧化应激的发生,Western blot、免疫荧光及q-PCR结果显示,随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加,G3BP1表达呈剂量依赖性降低。表明随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加,应激颗粒关键组分G3BP1表达受到抑制,睾丸组织及精母细胞的抗氧化能力下降,氧化应激损伤加剧。1.3G3BP1基因介导P38 MAPK/JNK通路在氟氯氰菊酯致睾丸及精母细胞功能障碍中的作用研究前部分结果显示氟氯氰菊酯可引起睾丸组织及精母细胞氧化-抗氧化稳态失衡,应激颗粒关键组分G3BP1的表达被抑制,这对MAPK通路的关键因子表达会引发怎样的改变呢?WB及q PCR结果显示,随着染毒剂量的增加,睾丸组织与精母细胞中JNK1/2/3,P38 MAPK、p-ERK蛋白及m RNA表达量降低,p-JNK1/2/3,p-P38 MAPK蛋白表达量增高,COX1及COX4呈现剂量依赖性降低,Caspase 3,Caspase 8和Caspase9明显升高,且TUNEL阳性细胞数随着染毒剂量的增加而增多,表明当G3BP1表达被抑制后,可引起JNK1/2/3,P38 MAPK信号的激活,干扰胞外信号调节激酶ERK的正常分泌,引起生精细胞内线粒体功能障碍及凋亡途径的激活,引起生精细胞的凋亡。1.4探究抑制及过表达G3BP1基因表达后其在氟氯氰菊酯致精母细胞损伤中的作用（1）过表达G3BP1可缓解氟氯氰菊酯诱导的细胞毒性,包括细胞膜受损程度、氧化应激程度、线粒体损伤程度构建G3BP1基因过表达慢病毒载体及G3BP1基因抑制表达慢病毒载体,通过研究发现,与对照组及抑制表达组相比,过表达G3BP1后染毒细胞LDH、MDA含量明显降低,SOD和T-AOC含量明显升高,抑制表达后结果与之相反。表明过表达G3BP1后,可缓解氟氯氰菊酯诱导的细胞毒性,细胞膜受损程度、氧化应激程度均有所缓解;抑制G3BP1表达后可加重氟氯氰菊酯诱导的细胞毒性,氧化应激程度增加。并且过表达G3BP1后,染毒细胞中ROS相对荧光强度相对降低,ATP含量相对升高,表明过表达G3BP1后,可缓解氟氯氰菊酯诱导精母细胞中ROS的产生,一定程度上抑制ATP下降,缓解线粒体损伤情况;抑制G3BP1表达后可加重线粒体损伤,ROS增加明显,ATP明显降低。（2）过表达G3BP1可抑制P38 MAPK/JNK通路的激活,减轻细胞内凋亡级联反应WB及q PCR结果显示,过表达G3BP1后,染毒细胞中JNK1/2/3蛋白及m RNA表达量增加,p-P38 MAPK蛋白表达量降低,ERK蛋白及m RNA表达量降低,而p-ERK蛋白表达量明显升高。抑制表达后与之相反。过表达G3BP1后染毒细胞中IL-6、TNF-α蛋白及m RNA表达量明显降低,COX1、COX4蛋白及m RNA表达量明显升高,Caspase3、8、9蛋白及m RNA表达量明显降低,抑制表达后与之相反。这进一步印证过表达G3BP1可抑制P38 MAPK/JNK通路的激活,缓解氟氯氰菊酯诱导的细胞损伤,减轻细胞内凋亡级联反应。结论:1.暴露于氟氯氰菊酯可引起大鼠睾丸及精母细胞损伤,可引起病理形态学、雄性激素水平的改变、抗氧化能力下降及炎症的发生。2.当细胞内抗氧化能力受损时,G3BP1表达及活性受到抑制,引起P38 MAPK/JNK通路激活,引起细胞内凋亡途径的激活,进而导致生殖细胞凋亡。3.干预G3BP1基因表达后,过表达G3BP1可通过调控P38 MAPK/JNK通路,明显缓解氟氯氰菊酯引起的精母细胞氧化应激、炎症及线粒体损伤、细胞凋亡情况。抑制G3BP1表达后可明显加重细胞损伤及凋亡。因此,G3BP1基因可通过调控P38MAPK/JNK通路参与氟氯氰菊酯所致的睾丸及精母细胞的氧化应激、炎症、线粒体损伤及细胞凋亡,进而影响氟氯氰菊酯对雄性生殖功能损伤的发生与发展。