中药大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palamatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Bail的干燥根及根茎。临床上,以生、熟大黄饮片常用。生大黄苦寒之性较强,泻下之力强烈,在临床上主要用于治疗热结便秘。与生大黄相比,熟大黄的泻下作用缓和,同时增强了活血祛瘀作用。生、熟大黄功效上的差异,其根源是炮制前后化学成分的变化引起的,其核心在于炮制改变中药药性。近年来,许多学者逐渐开展了对于中药药性理论以及炮制与药性相关性的研究。课题组前期已从宏观的功能药性的角度成功探明了生、熟大黄苦寒泻下作用变化的基本规律,而对于大黄的向位药性的研究,目前鲜有报道。向位药性也是中药药性理论之一,是对中药治疗疾病与脏腑相关性的总结,一般包括脏腑、经络、卫气营血等内容。大黄入气分,攻气滞,主要作用于肠道,可解决肠道功能问题,因此临床上大黄主要用于攻下,治大便不通,肠胃阻塞的急腹症。熟大黄偏入血分,能泄降胃中实热而凉血,攻除体内瘀血。血液瘀滞性疾病,如肌瘤、崩漏等,可以用酒制大黄。为研究大黄炮制前后向位药性的变化以及与气分血分之间的相关性,本课题在国自然基金“酒蒸改变大黄“向位药性”与“气分、血分”辩证相关性的科学诠释”的支撑下,基于课题组前期生、熟大黄物质基础及生物活性差异研究结果,采用便秘以及寒凝血瘀模型,进行药代动力学研究,通过分析生、熟大黄在不同模型下的药代动力学行为,明确成分在体内吸收、分布差异,揭示生、熟大黄向位药性变化的科学内涵,探索大黄饮片向位药性与气分、血分的相关性,为全面揭示大黄炮制前后药效差异提供了科学依据,同时拓宽了炮制学科的研究思路。一、生、熟大黄的化学成分表征本节基于RRLC-QTOF/MS方法,对生、熟大黄饮片中的化学成分进行定性分析。对采集到的生、熟大黄的定性质谱数据,采取分子特征提取法,快速地从总离子流图(TIC)中直接提取所有化合物信息。以各成分的峰面积为变量,采用单因素方差分析,确定了引起生、熟大黄化学成分差异的73个标志化合物。通过分析对照品的裂解规律,总结确定各类成分的特征碎片离子。根据不同类型化合物的特征碎片离子,对73个化学成分标志物进行推导和指认。其中,包括蒽醌类27个,二苯乙烯类16个、苯丁酮类11个以及其他类成分19个,明确了生、熟大黄在炮制前后化学成分发生明显变化。本节采用UPLC-DAD分析方法,对生、熟大黄提取物中12个主要化学成分进行定量分析,分别为没食子酸乙酯(1)、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(2)、莲花掌苷(3)、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷(4)、异莲花掌苷(5)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(6)、4’-羟基苯基-2-丁酮-4’-O-β-D-(2"-没食子酰基-6"-O-(4"’-羟基)-桂皮酰基)(7)、芦荟大黄素(8)、大黄酸(9)、大黄素(10)、大黄酚(11)以及大黄素甲醚(12)。经回收率、专属性、重复性、准确度以及精密度等方法学考察可知,建立的含量测定方法准确、可行。各成分的在生大黄提取物中的含量测定结果分别为 0.99%、0.23%、5.46%、1.81%、7.73%、0.29%、1.69%、0.05%、0.66%、0.19%、0.12%和0.36%,各成分在熟大黄提取物中的含量测定结果分别为 0.03%、0.18%、2.49%、1.76%、2.89%、0.14%、0.12%、0.13%、1.29%、0.23%、0.21%和0.55%。结果提示,炮制为熟大黄后,蒽醌苷、苯丁酮类成分含量下降,蒽醌苷元类成分含量增加。为进一步科学、准确分析生、熟大黄之间药代动力学参数的变化规律提供研究基础。二、生、熟大黄在正常大鼠的药代动力学研究基于UPLC-MS/MS技术,建立并测定给药后大鼠血浆以及组织中芦荟大黄素-3-CH2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的分析方法。采用多反应监测模式(MRM)进行分析,被测成分在线性范围内线性关系良好,专属性、准确度、精密度、稳定性、基质效应及回收率等方法学研究结果表明,该方法专属性强,灵敏度高,符合非临床药代动力学的生物样品分析方法的基本要求。采用所建立的分析方法,测定正常大鼠一次性灌胃给予生、熟大黄提取物后的不同时间血浆中各成分的浓度。根据血浆样品中各成分的浓度,绘制浓度-时间药时曲线,采用非房室模型计算各成分的药代动力学参数。研究结果显示,大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚在熟大黄中的达峰时间(Tmax)明显快于生大黄。大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷在生大黄中较高的血药浓度(Cmax)、药时曲线下面积(A UC0-24)以及在生大黄中较低的清除率(CLz/F),提示大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷在生大黄中吸收多,消除慢,生物利用度较高。除此之外,发现大黄酸以及芦荟大黄素在生大黄中吸收入血的量多,清除率低,生物利用度高,因此推测其可能是生大黄潜在的药效物质基础。其余三个成分,大黄酚,大黄素和大黄素甲醚等这三个成分在熟大黄中的体内滞留时间(MRT0-24)长于生大黄,但三个成分的血药浓度(Cmax)及药时曲线下面积(AUC0-24)在生、熟大黄中的变化不明显,结果提示这三个成分在生、熟大黄中的生物利用度无明显差异或者熟大黄中的生物利用度稍高,因此推测其可能是熟大黄潜在的药效物质基础。采用上述建立的分析方法,测定大鼠灌胃给予生、熟大黄提取物后,三个不同时间点(15 min、60 min、4 h)的组织中各成分的浓度。结果显示,随着随着时间的延长,大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚以及大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量有所降低,而相应的葡萄糖醛酸结合物的含量逐渐升高,提示蒽醌成分在体内发生了生物转化。生、熟大黄中各成分主要分布胃脏、大肠以及结肠中。组织分布动力学研究结果提示,不同成分在组织中的分布存在靶向性、向位性。此实验为进一步研究生、熟大黄在不同病理模型下的向位药性研究提供实验基础。三、生、熟大黄在便秘模型大鼠的药代动力学研究基于UPLC-MS/MS技术,建立并测定给药后便秘模型大鼠血浆以及组织中大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚及其葡萄糖醛酸结合物的分析方法。通过使用β-葡萄糖醛酸酶酶解生物基质中的蒽醌苷元葡萄糖醛酸代谢产物的前处理步骤,克服其对照品难以获得而无法定量的问题,实现样品中蒽醌苷元的葡萄糖醛酸结合物的快速定量。所有被测成分在线性范围内线性关系良好,专属性、准确度、精密度、稳定性、基质效应及回收率等方法学研究结果表明,该方法专属性强,灵敏度高,符合非临床药代动力学的生物样品分析方法的基本要求。采用已建立的UPLC-MS/MS方法,测定便秘模型大鼠血浆以及组织样品中各成分的浓度,绘制浓度-时间药时曲线,采用非房室模型计算各成分的药代动力学参数。本实验药代动力学研究结果显示,蒽醌苷、蒽醌苷元及蒽醌苷元结合物在熟大黄中的清除率(CLz/F)均高于生大黄组,结果提示,炮制为熟大黄后,各成分在体内的清除速度加快,成分在体内的蓄积时间会减少。结合生、熟大黄中大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷含量比值(1.03)结果分析,大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷在生大黄中具有较高的血药浓度(Cmax)、药时曲线下面积(AUC0-24);及其在生大黄中较低的清除率(CLz/F)。上述结果均提示,在便秘模型大鼠中,大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷在生大黄中的生物利用度明显高于熟大黄。除此之外,大黄酸以及芦荟大黄素在生大黄中的体内暴露量明显高于熟大黄,同时这两个成分在生大黄中较长的体内滞留时间(MRT0-∞),上述结果提示,大黄酸及芦荟大黄素在生大黄中的生物利用度明显高于熟大黄。除此之外,大黄酸葡萄糖醛酸、芦荟大黄素葡萄糖醛酸、大黄素葡萄糖醛酸、大黄素甲醚葡萄糖醛酸结合物在生大黄中的生物利用度较高。其余四个化合物:大黄素、大黄酚、大黄素甲醚及大黄酚葡萄糖醛酸在生、熟大黄中的生物利用度无明显差异。已有文献报道,大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷与芦荟大黄素均与大黄的泻下作用有关,因此推测黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酸葡萄糖醛酸结合物、芦荟大黄素葡萄糖醛酸结合物可能是生大黄发挥泻下作用的药效物质基础。在便秘模型大鼠的组织分布动力学研究结果显示,在灌胃给予提取物4h后,组织中的各成分仍有较高的分布浓度,结合各成分较长半衰期(t1/2),提示各成分在体内的消除较慢,存在蓄积现象。其中,大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚以及大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷主要分布于结肠以及大肠中;芦荟大黄素葡萄糖醛酸结合物主要分布结肠中,其中在生大黄中的组织分布浓度高于熟大黄,大黄酸葡萄糖醛酸结合物在多个组织均有分布,结果提示生、熟大黄在便秘模型下,成分在体内主要分布于结肠组织,作用部位具有明显的差异性,证实大黄通过在结肠中的向位性分布,发挥泻下作用。四、生、熟大黄在寒凝血瘀模型大鼠的药代动力学研究基于上述建立的UPLC-MS/MS技术,测定寒凝血瘀模型大鼠血浆以及组织中蒽醌苷元、蒽醌苷以及结合蒽醌的含量。对寒凝血瘀模型大鼠一次性灌胃给予生、熟大黄提取物后,测定给药后不同时间的血浆(15 min、30 min、60 min、2 h、6 h、24 h)以及组织(60 min、6 h)中蒽醌类成分的浓度。吸收动力学研究结果显示,在寒凝血瘀模型大鼠中,明确生、熟大黄的入血成分,大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚及其相应的葡萄糖醛酸结合物、大黄素甲醚、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷等均可能是熟大黄发挥活血化瘀作用的药效物质基础。寒凝血瘀模型下的组织分布动力学结果显示,大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷以及芦荟大黄素葡萄糖醛酸在脾脏中分布较多;而大黄酸以及大黄酸葡萄糖醛酸主要分布于血浆中;芦荟大黄素、大黄素以及大黄素葡萄糖醛酸结合物主要分布于肝中。与便秘模型下的药代动力学结果对比,上述成分在寒凝血瘀模型下的组织分布结果具有明显的差异性,提示在寒凝血瘀模型下,大黄中各成分在组织中的分布具有向位性,揭示生、熟大黄是通过分布于靶向组织,进一步发挥活血化瘀作用的。在便秘模型下,生、熟大黄中成分主要分布于结肠组织中,在寒凝血瘀模型下,成分主要分布于血浆、肝脏及脾脏中,结果显示,生、熟大黄在不同的病理模型下,分布具有明显的差异性。因此,推测大黄通过入气分,分布于结肠,进而发挥泻下作用;通过入血分,分布于肝脏、脾脏等脏器,进而发挥活血化瘀的作用,揭示了生、熟大黄向位药性变化的科学内涵,阐明了生、熟大黄向位药性的差异可能是其产生药效差异的重要原因,同时验证了向位药性与气分血分之间的相关性。本研究从向位药性的角度探索中炮制原理科学内涵,在丰富中药饮片炮制原理研究方法的同时,为同类中药的炮制研究提供了借鉴。