论文部分内容阅读
晚期胃癌患者约6O%死于腹膜转移方式,且腹膜转移在胃癌术后复发中占5O%左右,成为胃癌死亡的主要原因之一。目前虽经手术,化疗和放疗等传统治疗方式效果仍不十分理想。因此,寻找新的途径阻断胃癌腹膜转移对胃癌治疗和改善预后意义重大。肿瘤的生物靶向诊断和治疗目前颇受关注,噬菌体随机肽库技术为肿瘤的靶向治疗提供了切实可行的方法,采用噬菌体随机肽库技术,可以在欲筛选的靶标分子结构不明确的情况下,无需事先知道它们之间相互作用的区域及相互作用的性质来进行筛选,从而筛选出一些能与靶分子结合的特异性多肽。利用我们研究所建立的胃癌细胞系GC9811和胃癌腹膜高转移细胞系GC9811-P,经噬菌体随机肽库筛选,成功筛选出与胃癌腹膜高转移细胞特异结合的多肽PⅢ,本研究进一步验证该多肽的生物活性及分子机制,旨在为胃癌腹膜转移靶向基因、靶向药物治疗研究提供实验基础,进而指导临床诊治,以期达到阻断胃癌腹膜转移的目的。【目的】一.利用生物信息学方法对多肽PⅢ进行理化性质的预测及相似性的比较,为多肽PⅢ的结构与功能研究提供帮助;二.多肽PⅢ与胃癌腹膜高转移细胞亲和性的研究;三.多肽PⅢ拮抗胃癌腹膜浸润转移作用的研究;四.胃癌腹膜高转移潜能细胞GC9811-P与其亲本细胞GC9811的差异基因表达分析;五.研究与多肽PⅢ相结合的受体分子,为全面认识该分子促进胃癌细胞腹膜转移的机理提供理论基础。【方法】一.生物信息学方法对多肽PⅢ理化性质的预测及序列相似性的比较:1.应用ExPASy数据库分析多肽PⅢ的分子量、等电点和疏水性等理化性质;2.利用BLASTP、PDB_ISL和SCOP等数据库对多肽PⅢ的氨基酸序列与已知蛋白序列进行相似性比较。二.多肽PⅢ与胃癌腹膜高转移细胞亲和性的研究:1.采用竞争结合实验,随机挑选40个噬菌体单克隆进行测序,最终产生5个序列,通过竞争结合实验来鉴定高亲和力的噬菌体克隆,比较不同噬菌体克隆与腹膜高转移细胞GC9811-P的结合能力;2.细胞结合ELISA,将对数生长期的多种胃癌细胞,通过酶联免疫检测仪测定各孔吸光度A值,比较噬菌体克隆18与多种胃癌细胞的结合能力;3.竞争抑制试验,将不同浓度的合成肽与GC9811-P细胞孵育,加入对应的噬菌体克隆,计算噬菌体的结合力,以确定细胞与噬菌体的结合是否通过多肽来实现的;4.流式细胞仪和荧光显微镜检测N端标记FITC的多肽与细胞的结合;5.多肽PⅢ与GC9811-P孵育的时间、剂量关系;6.噬菌体内化试验:观察噬菌体与细胞的结合及是否能进入细胞内;7.裸鼠体内结合试验:将GC9811-P细胞接种于裸鼠腹腔,选腹水形成的裸鼠腹腔注入多肽PⅢ-FITC,收集腹膜及各脏器的瘤结节行冰冻切片,荧光显微镜下观察。三.多肽PⅢ抗胃癌腹膜转移作用的体内外实验:1.毒性测定实验:MTT法测定多肽PⅢ对胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P的直接毒性;2.细胞的迁徙实验:观察多肽PⅢ对GC9811-P细胞运动功能的影响;3.黏附实验:体外基质黏附试验检测多肽PⅢ对GC9811-P细胞与细胞外基质蛋白成分粘附能力的影响;4.侵袭实验:重组细胞基底膜侵袭抑制实验测定多肽PⅢ对GC9811-P细胞侵袭能力的影响;5.裸鼠体内治疗实验:采用胃浆膜下裸鼠原位接种转移模型,观察多肽PⅢ对胃癌细胞GC9811-P腹膜转移能力的影响,荷瘤鼠衰竭处死后观察腹膜转移率、转移灶数目及原发瘤的质量。四.胃癌腹膜高转移潜能细胞系与母系的差异基因表达分析:1.采用基因芯片技术,比较遗传背景相同但转移力有明显差异的两个细胞系GC9811和GC9811-P,分析其基因表达谱的差异;2.选取部分基因行RT-PCR、Western blot进一步验证基因芯片的准确性。五.与多肽PⅢ特异性结合的胃癌腹膜高转移细胞受体分子的分离:1.胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P细胞总蛋白和膜蛋白的提取;2.镍琼脂糖凝胶FF装柱,6-His与多肽PⅢ的偶联后与膜蛋白混合,不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱,收集各阶段洗脱峰;3.SDS-PAGE;4.胶内酶解和肽指纹图谱分析;5.蛋白质序列数据库检索。【结果】一.生物信息学方法对多肽PⅢ理化性质的预测及相似性的比较:经ExPASy数据库分析结果表明:多肽PⅢ呈弱酸性和亲水性,半衰期为1.9小时,分子式C57H92N12O19S1,分子量为1281.4。BLSTP分析结果表明:多肽PⅢ的序列与裂殖酵母、脂多糖生物合成蛋白质、组蛋白乙酰转移酶部分序列相似。二.多肽PⅢ与胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P具有特异亲和性:1.竞争结合试验结果表明:SMSIASPYIALE氨基酸序列出现频率最高,而且与GC9811-P的结合能力最强。我们把呈现该序列的多肽命名为多肽PⅢ,噬菌体克隆命名为phage18;2.细胞结合ELISA结果表明:phage18噬菌体在不同胃癌细胞上的吸光度不同,其中在GC9811-P细胞上的吸光度较其它对照细胞GC7901、GES-1、AGS、MKN-45、GC9811的上的吸光度均高;3.噬菌体内化试验提示phage18不仅可与GC9811-P细胞特异性结合,且可内化入靶细胞;4.竞争抑制试验结果表明:随着多肽PⅢ浓度增加,Phage18与GC9811-P细胞的结合率逐渐下降,当多肽PⅢ浓度在0.1μM和100μM时,Phage18与GC9811-P的结合率分别下降为82%和13%,进一步确定Phage18与GC9811-P细胞的结合是通过外源呈现肽来实现的;5.荧光显微镜观察多肽PⅢ-FITC与GC9811-P细胞孵育有明显的荧光,当足量的的未标记FITC的多肽PⅢ与多肽PⅢ-FITC加入到GC9811-P细胞共孵育时,荧光显微镜观察细胞荧光消失,说明多肽PⅢ具有与GC9811-P细胞特异结合的能力;6.流式细胞仪分析结果:多肽PⅢ-FITC与GC9811-P细胞共孵育时,荧光标记的阳性细胞数百分比为90.2%,荧光强度较对照组明显增强;且随着与多肽PⅢ孵育时间的延长、剂量的增加而明显加强,说明多肽PⅢ与GC9811-P细胞具有较强的特异结合能力,且呈时间和剂量依赖性;7.裸鼠体内结合试验结果:GC9811-P形成的腹膜瘤组织在荧光显微镜下显示较强的荧光,说明多肽PⅢ与GC9811-P细胞在裸鼠体内也具有较强的特异结合能力。三.多肽PⅢ具有抗胃癌腹膜转移的作用:1.MTT法测定多肽PⅢ对GC9811-P细胞无明显细胞毒性作用;2.损伤刮擦实验结果显示,多肽PⅢ组能显著抑制细胞的体外迁移能力;3.粘附实验结果显示多肽PⅢ有效的抑制了GC9811-P细胞的黏附,与单独孵育的GC9811-P对照组相比分别为(27±3.0)%)与(50.9±2.1)%,(P<0.01);4.侵袭实验结果表明多肽PⅢ与GC9811-P细胞共同孵育后,显示出明显的侵袭抑制能力,实验组和对照组细胞穿过人工基底膜胶侵袭细胞数分别为43.5±4.3和165.6±24.3,差异有统计学意义(P<0.01);5.裸鼠体内实验结果显示:将肿瘤细胞原位接种于裸鼠后给予多肽PⅢ治疗,与对照组比较腹膜转移灶的数目分别为(6.5±3.2)个和(26.3±5.2)个,腹膜转移率明显下降(P<0.01)。四.胃癌腹膜高转移潜能细胞系与母系的差异基因表达结果:1.在11901个候选基因中,筛选出248个差异表达基因。GC9811-P与GC9811相比,表达上调基因有218个,下调的有30个,包括DNA合成和错配修复基因如H3F3A、细胞增生基因、蛋白合成与修饰基因、信号传导基因和离子通道与运输蛋白相关基因等;2.半定量RT-PCR和Western blot检测PTEN、S100A4、CTNNB1,结果验证了基因芯片数据的可靠性。五.与多肽PⅢ特异性结合的胃癌腹膜高转移细胞受体分子的分离:1.与多肽PⅢ结合膜蛋白的洗脱,PⅢ结合膜蛋白在梯度洗脱112 min后,咪唑浓度为300 mmol/ L时洗出;2.从电泳图中看出,除相对分子质量为20- 40Kd处蛋白带外,还存在相对分子质量较大的一条60Kd左右的蛋白条带,表明洗脱样品中存在多肽PⅢ结合膜蛋白的多聚体;3.肽质量指纹图谱,将洗脱的蛋白经蛋白酶消化、干燥后,用CHCA基质溶液垂悬,进行MALDI-TOF-MS检测,得到肽质量指纹图谱。提取特异性肽段的分子量组合,通过Mascot数据库检索,结合SDS-Page条带上相应蛋白质的分子量,确定PⅢ多肽结合受体蛋白可能为血红素加氧酶-1(Heme oxygenase 1)与ST2蛋白,基因名为IL1RL1(Interleukin-1 receptor-like 1),分子量63KD。【结论】1.利用生物信息学蛋白数据库发现多肽PⅢ氨基酸序列与某些已知蛋白某些结构域序列相似,为多肽PⅢ生物学功能的进一步研究提供了思路和线索;2.多肽PⅢ与胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P具有特异亲和力;3.多肽PⅢ能有效拮抗胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P的腹膜转移作用;4.GC9811- P细胞胃癌腹膜转移是多基因共同作用的结果,这种作用的关键可能与血红素加氧酶-1和ST2蛋白有关。