论文部分内容阅读
目的:探讨萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)对肺气肿大鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)的影响。方法:1.肺气肿大鼠模型构建:采用脂多糖联合熏烟法构建模型。取SPF级成年雄性wistar大鼠18只,随机分为对照组(6只)和模型组(12只)。模型组大鼠分别于d1、d14气管内滴注200μg脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS;生理盐水配制成200μg/200μL溶液),第2~60天(除d14)在自制熏烟箱被动吸香烟,2次/日,12支/次,30min/次,持续8周;对照组大鼠以生理盐水替代脂多糖行气管滴注,正常空气吸入。8周后,取各组大鼠右肺后叶做病理切片,HE染色光镜下观察,鉴定模型;2.原代肺泡巨噬细胞提取及干预:造模成功后,两组大鼠均行支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL),取灌洗液行细胞计数,提取、纯化AM,用不同浓度SFN(0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L)干预肺气肿大鼠AM 16 h。依处理方法不同,将AM分为五组:对照组、SFN0组、SFN5组、SFN10组和SFN20组;3.实验室检测:3.1采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清液中TNF-α含量;3.2采用蛋白印迹法(Western blot)分别检测各组AM中转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)及其下游的靶基因醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO1)蛋白相对表达量;3.3采用western blot法、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法分别检测各组AM中核因子(Nuclear factor,NF)-κB蛋白及其m RNA表达水平。结果:1.造模前对照组与模型组大鼠体重比较无明显差异(211.97±8.71 g VS 206.32±6.52 g,p>0.05)。经熏烟8周后,模型组大鼠体重较对照组显著下降(567.48±24.38 g VS 358.86±20.75 g,P<0.01);2.模型组大鼠支气管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中白细胞总数及AM比例均较对照组显著增加,分别为(2.79±0.42)×106/m L,(98.7±1.0)%和(0.77±0.16)×106/m L,(90.0±2.5)%(均P<0.001);3.TNF-α在SFN各浓度组中含量均高于对照组(对照组:12.2±2.7pg/m L;SFN0:150.7±11.0 pg/m L;SFN5:133.1±13.7pg/m L;SFN10:65.3±14.8pg/m L;SFN20:48.2±11.1 pg/m L),且随SFN干预浓度增加,TNF-α含量呈逐渐下降(均P<0.05);4.与对照组相比,SFN0组Nrf2蛋白胞核表达减少,胞浆表达增加(均P<0.05),随SFN干预浓度增加,Nrf2胞核表达量逐渐增加,胞浆相应减少(均P<0.05);5.与对照组相比,SFN0组NQO1、HO1蛋白表达减少;随SFN干预浓度增加,NQO1、HO1蛋白表达逐渐增加(均P<0.05),且NQO1、HO1表达量与各组细胞培养上清液中TNF-α含量呈负相关(r=-0.918,P<0.01;r=-0.939,P<0.01);6.对照组AM中NF-κB蛋白的胞浆表达大于胞核。与对照组相比,SFN0组NF-κB蛋白胞核表达显著增加,胞浆表达减少(均P<0.05);随SFN干预浓度增加,NF-κB胞核表达逐渐减少,胞浆表达相应增加(均P<0.05);7.与对照组相比,SFN各浓度组NF-κB m RNA表达水平均高于对照组(均P<0.05),但SFN各浓度组间无统计学差异(P>0.05)。结论:1.萝卜硫素抑制肺气肿大鼠肺泡巨噬细胞释放TNF-α;2.萝卜硫素通过促进Nrf2核内移,增加下游靶基因NQO1、HO1转录表达,从而抑制AM释放TNF–α;3.萝卜硫素通过减少NF-κB核内移,从而抑制AM释放TNF-α。