肝癌患者PBMCs中环状RNA表达谱鉴定及诊断价值分析

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目的越来越多地研究揭示,环状RNA(Circular RNAs,circRNAs)与癌症的发生、发展显著相关,参与癌细胞的增殖、侵袭、凋亡、浸润以及转移;此外,circRNAs较强的抗逆性、稳定性和疾病特异性赋予其作为多种疾病尤其是癌症生物标签的鲜明优势。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率和死亡率居全世界各类恶性肿瘤前列,尤其在我国HCC的发病率和死亡率居高不下,主要原因可能与长期以来HCC早期诊断率低且没有特异的治疗靶点,患者因而缺失早期治疗的最佳时机。因此亟待开发一种无创性、敏感度高、特异性强的HCC诊断生物标志物。本研究通过高通量测序(RNA-seq)技术分析HCC患者与正常对照组外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)中circRNAs表达谱并筛选显著差异表达的circRNAs。实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)验证显著差异的circRNAs;生物信息学预测其潜在的功能机制;最后探究了显著差异的circ0000798作为HCC生物标志物的临床潜在诊断价值,为探索circRNA作为HCC诊断及潜在治疗靶点奠定基础。方法取4例原发HCC患者和3例正常对照者新鲜外周血作为研究对象,分离PBMCs,提取总RNA,RNA-seq分析PBMCs中circRNAs表达谱变化。筛选显著差异表达(Fold change,FC)≥2或≤0.05,P<0.05)的circRNAs。GO和KEGG分析差异表达的circRNAs涉及的潜在功能和信号通路。qRT-PCR对所得6种显著差异的circRNAs在72例HCC患者和30例健康对照者PBMCs样本中再次验证。分析探讨显著差异表达的circ0000798与HCC患者临床病理参数的相关性,使用受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC)和曲线下面积(Area Under Curve,AUC)评估circ0000798作为HCC患者及区分HCC患者早-晚期生物标志物的潜在能力。最后Kaplan?Meier法分析circ0000798与HCC患者的预后相关性。结果RNA-seq分析HCC患者与正常对照者PBMCs共鉴定出5609种差异表达的circRNAs。其中在HCC患者PBMCs中显著差异表达的有58种(21种上调,37种下调)。GO和KEGG分析发现差异表达的circRNAs多涉及免疫和免疫相关的信号通路。内源性竞争RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)网络构建表明一个circRNA可结合多个miRNAs,一个miRNA也可结合多个circRNAs,调控免疫和免疫相关的分子及信号通路。qRT?PCR验证3种上调的circRNAs(hsacirc0005505,hsacirc0001394和hsacircRNA0000798)和3种下调的circRNAs(hsacirc0004771,hsacirc0001074和hsacircRNA0067735),结果表明6种circRNAs在HCC组的表达与测序结果一致。circ0000798的表达水平与HCC患者主要的临床病理参数显著相关。HCC患者和正常对照者PBMCs中(总数102人)circ0000798的ROC曲线下面积(Area Under Curve,AUC)达到0.703(95%confidence interval(CI):0.604-0.803;p=0.001),而HCC患者PBMCs中circ0000798(总数72人)的AUC达到0.909(95%confidence interval(CI):0.840-0.978;p<0.001)。结论本研究为首次系统性鉴定HCC患者和正常对照者PBMCs中circRNAs的表达谱变化。进一步临床分析和生物信息学预测揭示circ0000798可作为HCC无创性生物诊断标志物,为HCC的早期诊断和治疗提供了新思路。
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