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犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)是Eugster于1977年从患出血性肠炎犬的粪便中新发现的一种小DNA病毒,属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)猫细小病毒亚群。病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征,并可引起幼犬的心肌炎,对养犬业危害很大。CPV基因组为单股负链DNA,全长为5323bp,编码非结构蛋白(NS1、NS2)和结构蛋白(VP1、VP2)。结构蛋白VP2是病毒衣壳蛋白的主要成分,并可以诱导机体产生中和抗体,决定病毒的抗原性和宿主范围。自从早期CPV-2出现以来,CPV己演化出多种新抗原型,先是CPV-2a于1979年被分离,随后CPV-2b于1984年被发现。目前,CPV-2在犬群中已被CPV-2a和CPV-2b所取代。最近,另一种新的抗原型CPV-2c被发现,并被证实存在于意大利、越南、西班牙、德国、英国、美国以及乌拉圭等国家。本研究主要目的是:(1)建立犬细小病毒血清抗体间接ELISA检测方法,并对杭州地区CPV血清流行病学进行调查;(2)从分子流行病学角度,探明杭州地区犬细小病毒的流行和变异情况。
采集疑似病犬粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞进行病毒分离与鉴定。通过PCR检测、HA-HI试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化,获得一株犬细小病毒,并命名为HZ0761。F81细胞感染后24h出现明显的细胞病变;在病料和感染的F81细胞中均扩增出CPV VP2基因的特异性片段;病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1:28,其血凝性能被特异性抗体所抑制;IFA可见特异性亮绿色荧光;电镜观察感染的F81核内可见20nm左右的病毒颗粒。病毒液的TCID50为104.8/mL,VP2基因序列分析显示该毒株为CPV-2a。
以HZ0761基因组为模板,扩增其VP2基因全长,构建重组表达质粒pET30a-VP2。将重组质粒转化E coli Rosetta株,经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达。Western-blot表明重组蛋白可以与CPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用纯化后的重组蛋白为抗原,初步建立了CPV血清抗体间接ELISA检测方法。同时利用IFA和ELISA方法对杭州地区犬群CPV血清流行病学进行调查:共检测血清84份,IFA阳性56份,阳性率66.7％,ELISA阳性54份,阳性率64.3％。以IFA为标准计算ELISA方法的敏感性为79.3％,特异性为76.9％。
为探明杭州地区CPV的流行和变异情况,共收集病料样品58份。经PCR检测阳性51份,占87.9％。PCR扩增阳性病料的VP2基因,PCR产物经纯化后,克隆入pMD18-T载体中,进行序列测定。结果显示:51份病料样品中,CPV-2a45份,占88.2％;CPV-2b6份,占11.8％。分型过程中发现在42份2a和3份2b中均出现两处连续核苷酸变异(970T-A、971A-T)。从系统进化树可以看出,CPV杭州株2a型与2b型各自形成明显的分支,970/971突变株在各自基因型分支内部也形成了明显的分支,说明CPV杭州株在进化上开始显露其自身的特点。利用SNAP对VP2基因进行分析发现,整个VP2基因较为保守。根据dN-dS值和extropy值可将VP2分为三个保守区和两个易变区。在四个主要的抗原表位区中,Loop3和Loop4是最易发生抗原漂移的区域,是新突变株发生突变的主要区域,也是需要重点调查和监测的区域。通过与疫苗株序列的比较,我们发现该地区野毒株以CPV-2a为主并与疫苗株亲源关系较远。
本研究初步探明了杭州地区犬细小病毒的存在和流行情况,CPV以2a型为主,初步建立了CPV血清抗体间接ELISA诊断方法,通过对病毒变异特点的分析,为更好预防和控制该病奠定了基础。