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猪流感（Swine Influenza,SI）是猪流感病毒（Swine Influenza Virus,SIV）引发的猪的一种突发性、高度接触性呼吸系统传染病。该病特点为突发,高热,呼吸困难等。它与感染人类的流感病毒同属,能感染人、禽类、其它动物等,具有人畜共患的特性。同时,猪做为流感病毒基因重组的“混合器”和新型毒株产生的“孵育器",在新型流感病毒的暴发,流感病毒跨越种间屏障传播中起重要作用。这些特征也决定了猪及SIV在新型流感病毒的产生、流行过程中具有不可代替的地位。研究SIV有助于对流感病毒的进化方式、流行规律以及跨种传播机制等的了解,对制定有效的防制计划具有重要意义。本研究利用反向遗传学技术成功构建了猪流感病毒8质粒系统,并拯救出一株重组猪流感病毒,重组毒株与其亲本毒株生物学特性比较具有定向选择的优势及抗原性强,毒力弱,鸡胚生长性强等特点。这为研究猪流感病毒暴发、毒株跨种间传播及反向遗传学技术疫苗研制提供了依据。同时通过对H1,H3亚型HA单因子血清进行优化,为猪流感流行病学调查以及毒株亚型鉴定提供快速,准确的血清学方法。试验一:重组猪流感病毒候选骨架毒株筛选通过对实验室分离保存的H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Gansu/SS01/2014（H9N2）（简写为GS/SS01/14）进行全基因序列测定、种系进化分析、病毒滴度测定和其对SPF鸡胚以及BALB/c小鼠感染性等试验对病毒的生物学特性进行分析。测序结果显示:该分离株的HA裂解位点氨基酸序列为333PARSSR/GL340,是单个存在的不连续碱性氨基酸序列,该氨基酸序列与低致病性禽流感病毒（LPAIV）氨基酸序列特征相符。该分离株8个基因片段来源于同一亚型禽流感病毒,与NCBI报到的已知禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/245/2004（H9N2）同源性很高,达99.9%。HA试验的血凝价为210,EID50试验结果为10-7.68,表明GS/SS01/14鸡胚生长能力强。病毒对小鼠的感染性试验显示,该分离株在小鼠体内复制能力弱,含量低。以上研究表明:GS/SS01/14能为重组猪流感病毒提供基因骨架,为后续的反向遗传学试验技术提供基础。试验二:H1N1亚型猪流感重组株的构建为了利用反向遗传技术构建候选猪流感疫苗株,通过建立重组猪流感病毒反向遗传体系,拯救出具有目的生物学特性的猪流感病毒。本试验首先使用RT-PCR方法获得禽流感GS/SS01/14骨架毒株的PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M、NS 8条基因片段,并分别对时下流行的H1N1、H3N2亚型SIV的HA,NA基因进行合成与扩增,然后用同源重组技术分别将GS/SS01/14骨架毒株的8个基因和H1N1,H3N2亚型SIV的HA、NA基因克隆到双向表达载体pBD中,构建出GS/SS01/14骨架毒株的8质粒系统和以GS/SS01/14为骨架的“6+2”重组H1N1,H3N2亚型SIV的8质粒系统。将构建好的3组8质粒系统通过转染293T细胞导入到细胞内,细胞培养2日后收获上清液接种到10日龄鸡胚的尿囊腔中,然后通过血清学试验与TCID50试验检测鸡胚尿囊液中的病毒含量。结果显示构建的反向遗传操作系统成功拯救出H9N2亚型GS/SS01/14和重组H1N1亚型SIV,血凝效价分别达10log2和8log2,在鸡胚中具有良好生长能力。因此,本试验成功建立了H9N2亚型AIV GS/SS01/14和重组H1N1亚型SIV反向遗传系统,重组H1N1亚型SIV可作为疫苗株的候选毒株。试验三:猪流感病毒HA蛋白单因子血清的制备为了对现有的H1和H3亚型SIV血清学试验检测方法进行优化,更快速、高效地了解SIV在我国猪群中的分布范围与流行状况,本试验制备了H1和H3亚型猪流感病毒血凝素蛋白（HA）单因子血清。试验分别将H1和H3亚型的HA基因克隆到pCAGGS真核表达载体中,构建出具有表达HA蛋白能力的真核质粒。重组质粒经酶切鉴定证实已将目的HA基因插入其中,间接免疫荧光试验证实能在体外瞬时表达并通过Western Blot试验表明能表达目的蛋白。质粒大量提取后,肌肉接种四周龄SPF鸡200μg/只,三免后进行心脏采血分离鸡血清。通过血凝抑制（HI）试验检测制备血清的效价。试验结果显示HA蛋白单因子血清抗体达4log2-6log2。交叉HI试验结果显示2个亚型血清间无交叉反应现象,特异性强。本试验制备的单因子血清可用于H1和H3亚型猪流感病毒的血清学调查,以便及时了解SIV的分布,为SIV疫苗的应用明确方向。