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T细胞在同种移植物排斥反应和移植物抗宿主病中起主要作用,CD4+和CD8+T细胞都参与了这些反应。T细胞TCR识别的配体是抗原肽和MHCⅠ或MHCⅡ分子形成的复合物(pMHC),分别被CD8+和CD4+T细胞识别。急性排斥反应中T细胞对同种抗原的直接识别起主要作用。研究表明T细胞识别抗原肽／同种MHC复合物和抗原肽／自身MHC复合物一样通常也是pMHC特异性的,并且TCR和同种MHC分子的相互作用方式与传统的自身MHC分子提呈抗原肽给TCR识别是一样的。抗原肽特异性的的同种反应性T细胞被称为同种限制性T细胞。已有研究证实是CD4+而非CD8+T细胞在同种排斥反应中起本质作用：一方面CD4+T可以辅助其他淋巴细胞参加免疫反应,另一方面它本身也是移植物排斥反应的效应细胞。同时,临床资料显示移植物抗白血病反应(GVLR)使白血病病人的病情得以缓解,并且移植物抗肿瘤反应(GVTR)在许多实体瘤的病例中也得到证实,这是由于供者T淋巴细胞对宿主的白血病细胞及肿瘤细胞发生了免疫反应。尽管许多研究都集中于CD8+T细胞在GVLR或者GVTR中的作用并且发现CD8+T细胞在其中发挥效应作用,但实际上在GVLR中需要CD4+T和CD8+T细胞两者共同参与。由于CD4+T细胞在普通免疫反应和同种反应中均发挥重要作用,我们认为同种反应性CD4+T细胞尤其是同种限制性CD4+T细胞可能在GVLR或者GVTR中起重要作用。本研究目的是要建立一个诱生同种限制性CD4+T细胞的方法并且观察这种CD4+T细胞的肿瘤排斥效应。本研究先制备出肿瘤抗原肽/HLA-DR15/IgG1-Fc二聚体,再将结合了此二聚体的HLA-DR15阴性的单核细胞和自体的外周血淋巴细胞(PBL)共培养诱导出肿瘤肽特异性的同种CD4+T细胞,并将此细胞过继到荷瘤裸鼠体内,发现其可以明显抑制荷瘤裸鼠体内的肿瘤生长。论文共分为三部分,其主要内容与结果如下：一、制备HLA-DR15/IgGl-Fc二聚体,并且该二聚体能有效结合到]HLA-DR15阴性(DR15-ve)个体的单核细胞表面采用RT-PCR方法从人宫颈癌细胞系SiHa(为HLA-DR15基因型)中扩增DRa链和DRp链的信号肽及胞外序列以及转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链序列,将扩增的DRa段和DRβ段分别和转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链区连接形成DRa-Fos和DRP-Jun,再将DRa-Fos和人IgG1的Fc段相连,构建出重组载体pFastBacTM(?)ual+[DR15/IgG1-Fc]。将此载体转化大肠杆菌DH10BacTM,得到重组的穿梭质粒Bacmid+[DR15/IgG1-Fc],将此穿梭质粒转入昆虫细胞Sf9中,收获上清得到成熟病毒颗粒,再用此病毒颗粒大量感染Sf9细胞,收集病毒感染的Sf9细胞培养上清,通过葡萄球菌蛋白A (SPA)柱纯化得到可溶性DR15/IgG1-Fc二聚体融合蛋白(简称DR15二聚体)。ELISA和Western-blotting检测均证实DR15二聚体产物由两部分组成：二聚化的DR15的胞外段提供有效的TCR反应部分,IgG1-Fc段能与单核细胞表面高亲和力受体FcyRI结合。将纯化的DR15二聚体与DR15-ve个体的单核细胞孵育,用流式细胞术检测具有HLA-DR15阳性表型的单核细胞百分数以确定二聚体与DR15-ve单核细胞的结合能力。流式分析结果显示DR15-ve单核细胞结合DR15二聚体后大多数具有HLA-DR15阳性表型,说明DR15二聚体可以有效结合到DR15-ve单核细胞表面。二、结合了抗原肽/HLA-DR15/IgG1-Fc二聚体的单核细胞诱导肽特异性的同种CD4+T细胞的产生为诱导抗原肽特异性的同种CD4+T细胞,本研究建立了一个共培养体系：纯化的DR15二聚体加载其限制性肽后结合到酸洗过的DR15-ve个体的单核细胞表面,形成共培养体系中的刺激细胞；同一个体来源的外周血淋巴细胞(PBLs)作为共培养体系中的效应细胞。共培养7 d后,通过CFSE稀释法由流式细胞仪检测到共培养体系中的CD4+T细胞发生了明显的增殖。再次用同样方法进行二次刺激,7 d后,该体系中淋巴细胞的特异性肽/DR15二聚体染色阳性细胞数显著高于对照,且诱导出的特异性肽／DR15二聚体阳性的CD4+T细胞能特异性的分泌细胞因子IFN-y,这些实验证实本研究所诱导的同种CD4+T细胞具有pMHC特异性。三、肿瘤肽特异性的同种CD4+T细胞能有效抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长人宫颈癌细胞SiHa是HLA-DR15基因型且高表达E7蛋白,可以作为本研究诱导的E7肽特异性的同种CD4+T的靶细胞。将经过二次刺激的淋巴细胞通过磁珠阴性分选得到较纯的肽特异的同种CD4+T细胞,再将其过继到荷SiHa瘤细胞的裸鼠体内,发现过继肿瘤抗原肽特异性的同种CD4+T细胞的裸鼠体内的肿瘤生长受到抑制,其生存期与对照组相比显著延长。免疫组织化学检测发现在特异性组有明显的人CD4+细胞浸润,而对照组不明显。总之,本研究通过将DR15-ve的淋巴细胞和结合了肽／DR15二聚体的自身单核细胞共培养诱导产生了肿瘤肽特异性的同种CD4+T细胞,这种CD4+T细胞在体外具有特异性的生物学功能,在体内可以明显地浸润到肿瘤组织局部,具有抑制肿瘤生长的作用,证实了CD4+T细胞也参与了GVTR (graft versus tumor reaction)并起重要作用。这不仅为诱导同种pMHC限制性CD4+T细胞提供了新的思路,也为肿瘤的过继免疫治疗提供了一种新的策略。本研究的创新点和意义：1.本研究将加载抗原肽的HLA-DR15/IgGl-Fc二聚体(DR15二聚体)结合到DR15-ve单核细胞表面,使之能够对自身PBLs’‘提呈”单一的同种pMHC,这种“提呈”单一pMHC的单核细胞和自身PBLs在体外共培养,能有效刺激自体PBLs产生同种限制性的CD4+T细胞。2.将针对肿瘤抗原的同种限制性CD4+T细胞过继输入到荷瘤裸鼠体内,可以有效抑制肿瘤生长；在肿瘤生长部位,发现有明显的CD4+T细胞浸润,从而证实了同种pMHC限制性CD4+T细胞参与了GVTR。这不仅为诱导同种pMHC限制性CD4+T细胞提供了新的思路,也为肿瘤的过继免疫治疗提供了一种新的策略。