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目的:放疗（radiotherapy,RT）不仅可以通过损伤DNA直接损伤肿瘤组织,还可以通过引发强烈的铁死亡造成细胞死亡。铁死亡在RT诱导的细胞死亡和肿瘤抑制中发挥重要作用,并介导RT与免疫治疗的协同作用,但辐射诱导肿瘤细胞铁死亡的调控机制目前尚不清楚。我们通过生物信息学方法筛选出食管鳞状细胞癌RT前后差异表达的基因,从中选出与铁死亡密切相关的基因支链氨基酸转氨酶1（Branched chain amino acid transaminase1,BCAT1）,进而通过系列实验确定BCAT1对肿瘤细胞生物学行为、RT耐受以及肿瘤细胞铁死亡进行深入研究,本课题旨在阐明BCAT1在肿瘤RT耐受中的作用,为深入研究RT对肿瘤细胞的作用机制以及推动RT的联合治疗提供实验数据。方法:1、生物信息学分析（1）差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）的筛选:利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）以及基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和R包筛选符合要求的数据集并进行RT前后肿瘤组织DEGs分析,qPCR验证并确定候选基因。（2）BCAT1相关的生物功能分析:利用Linked Omics数据库（www.linkedomics.org/login.php）对TCGA-ESCA队列中筛选出的BCAT1基因相关功能进行分析,并利用GSEA富集分析对基因本体生物学过程（GOBP）、细胞组成（GOCC）、分子功能（GOMF）以及京都基因与基因组百科（KEGG）途径进行了功能模块化的分析。（3）BCAT1与铁死亡关键基因的关系:利用GEPIA网站（http://gepia2.cancer-pku.cn/）的Correlation Analysis模块分别分析BCAT1与铁死亡关键基因GPX4和SLC7A11的相关性。2、细胞实验验证差异表达基因（1）检测食管鳞状细胞癌TE-1细胞放疗前后BCAT1的变化:TE-1细胞在接受5Gy电子射线处理后,RT-qPCR以及Western Blot验证TE-1细胞处理前后BCAT1的表达情况。（2）过表达BCAT1后对TE-1细胞生物学行为的影响:将TE-1细胞通过Lipofectamine 2000转染BCAT1的c DNA质粒;RT-qPCR和Western blot分别检测转染细胞的基因和蛋白表达,运用CCK8实验检测细胞增殖能力的变化,划痕和Transwell侵袭实验验证BCAT1过表达后TE-1细胞的侵袭转移能力。RT-qPCR和Western blot检测上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transformation,EMT）相关指标E-Cadherin、N-Cadherin和MMP2表达情况。（3）BCAT1过表达对TE-1细胞RT耐受的影响:应用5GY的电子射线处理过表达BCAT1的TE-1细胞,免疫荧光检测TE-1细胞中DNA损伤标记物γ-H2AX的表达变化。（4）BCAT1与铁死亡之间的关系:利用铁死亡诱导剂（RSL3）处理BCAT1转染组和对照组TE-1细胞24h后,利用试剂盒检测细胞内脂质过氧化MDA、铁含量的变化以及活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）含量的变化,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）的表达。（5）BCAT1调控RT诱导的铁死亡:RT处理BCAT1转染组和对照组TE-1细胞后,检测细胞内MDA和铁含量的变化,ROS含量检测;RT-qPCR和Western blot检测各组细胞中GPX4的表达情况。结果:1.通过对TCGA数据库食管鳞癌病人样本进行差异分析,发现在RT与未RT的食管鳞状细胞癌病人中表达上调的DEGs有272个,下调的DEGs有429个,另外通过与GEO数据库中的数据集整合分析筛选出四个共同DEGs,通过实验验证只有BCAT1在RT前后的食管鳞状细胞癌病人中具有显著差异表达,且RT后表达下调（p＜0.05）;同时也发现BCAT1在大多数癌症当中表达是增加的。2.GO和KEGG通路富集显示与BCAT1相关基因主要富集在巨噬细胞活化、过氧化物酶体转运、细胞外囊泡生物发生、线粒体RNA代谢过程等生物过程,以及主要参与细胞外基质相互作用途径、PI3K-AKT信号通路、癌症中的蛋白聚糖、细胞粘附分子等通路。3.GEPIA网站Correlation Analysis模块分析结果显示BCAT1与铁死亡相关基因如GPX4和SLC7A11的相关性,BCAT1与GPX4以及SLC7A11呈显著正相关（p＜0.05）。4.RT-qPCR和Western Blot实验结果表明BCAT1在食管鳞癌细胞TE-1 RT前后存在差异表达（p＜0.05）,经电子射线处理后其表达量明显降低（p＜0.05）。5.TE-1细胞转染pc DNA-BCAT1质粒后BCAT1表达比NC组明显增加;划痕实验和Transwell迁移实验结果显示BCAT1转染组肿瘤细胞迁移侵袭能力比对照组细胞明显增强（p＜0.05）;RT-qPCR和Western Blot实验结果表明,转染pc DNA-BCAT1的TE-1细胞中N-Cadherin和MMP2表达量明显升高（p＜0.05）,而E-Cadherin表达量是降低的（p＜0.05）;CCK8增殖实验结果也表明BCAT1转染组肿瘤细胞增殖能力比对照组明显增强（p＜0.05）。6.荧光共聚焦显微镜观察表明转染BCAT1质粒的TE-1细胞RT后DNA损伤标志物γ-H2AX荧光强度明显低于单独RT组或单独转染组（p＜0.05）。7.MDA、铁含量以及ROS含量检测结果显示TE-1细胞加入RSL3之后MDA含量、铁含量和ROS含量显著高于对照组（p＜0.05）,而过表达BCAT1之后又能使得MDA、铁含量和ROS含量降低（p＜0.05）;另外RT处理后的TE-1细胞MDA、铁含量以及ROS含量显著高于对照组,而RT联合BCAT1转染的TE-1细胞内MDA含量、铁含量和ROS含量又会显著降低（p＜0.05）。8.RT-qPCR和Western Blot实验结果表明在TE-1细胞中过表达BCAT1之后,GPX4蛋白的表达量明显高于对照组（p＜0.05）,用铁死亡诱导剂RSL3处理TE-1细胞,与空白组相比,加入RSL3的细胞GPX4表达量会降低（p＜0.05）,而过表达BCAT1之后又能使得GPX4表达量增加（p＜0.05）。结论:1.RT可显著下调食管鳞状细胞癌患者和肿瘤细胞中BCAT1的表达。2.过表达BCAT1可以影响食管鳞状细胞癌TE-1细胞的增殖、侵袭、迁移能力。3.BCAT1可以抑制食管鳞状细胞癌TE-1细胞的铁死亡,从而增强TE-1细胞对RT的耐受性。