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研究背景肾母细胞瘤(nephroblastoma)又名肾胚胎瘤、wilms瘤(WT)，是儿童最常见的腹膜后实体肿瘤。自90年代以来，肿瘤手术切除率近于100.0％，5年生存率达到80.0％。由于肾母细胞瘤为先天性疾病，发病年龄较低，儿童又有其自身特点无法及时准确感知病情，且目前世界范围内缺乏行之有效的早期检测手段，已有的B超、CT、静脉肾盂照影(IVP)等检查手段只有当肿瘤长到一定大小时才能被发现，尚无法满足临床无创、简便、高效、快速的早期诊断要求。临床需要特异性好、灵敏度高、无创、痛苦小的肿瘤标记物，特别是血清标记物的研发及其相应检查方法的建立。蛋白组学的发展为肿瘤诊断提供了新的思维和技术平台。本研究用蛋白组学的表面增强激光解吸电离—飞行时间质谱(Surface Enhanced Laser Desorption／Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术和生物信息学的方法，分析肾母细胞瘤患儿、其他小儿腹腔实体肿瘤患儿和正常小儿的血清中的差异蛋白，筛选出特异的蛋白质标记物，探讨用于肾母细胞瘤早期诊断的血清蛋白质指纹图谱模型，以建立高特异性和敏感性的肾母细胞瘤诊断模型，同时评价该模型对肾母细胞瘤诊断的应用价值。研究目的检测肾母细胞瘤患儿血清蛋白质，筛选特异的蛋白质标记物，构建用于肾母细胞瘤早期诊断及鉴别诊断的血清蛋白质指纹图谱模型，并探讨基于支持向量机的血清蛋白质指纹图谱模型在肾母细胞瘤诊断中的应用。材料与方法1．材料1．1标本75例血清标本：肾母细胞瘤30例，其他腹部实体肿瘤25例(神经母细胞瘤9例、肝母细胞瘤5例、胰母细胞瘤2例、腹膜后恶性畸胎瘤5例、横纹肌肉瘤3例、肾上腺皮质癌1例)，正常对照组20例。所有恶性肿瘤标本均经病理证实。肾母细胞瘤组男16例，女14例，平均年龄2.8±0.1岁。其他小儿腹部实体肿瘤组男11例，女14例，平均年龄3.5±0.1岁。正常对照组与肾母细胞瘤组年龄、性别相匹配。1．2设备表面增强激光解析电离—飞行时间质谱(Surface Enhanced Laser Desorption／Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)，PBSⅡ~+ Ciphergen Inc．美国)。主要参数：收集范围为1000-50000；优化范围为2000-30000．1．3芯片弱阳离子交换(WCX2)蛋白芯片。1．4应用软件和标记物评价指标应用软件：Proteinchip Software 3．1，Biomarker Wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包。支持向量机(SVM)：MATLAB6.50SU-SVM工具箱。评价实验的指标：灵敏度、特异性、Youden指数。2．方法2．1血清样本处理：U9溶液处理冰浴中解冻的血清标本，100Mm NaNC(PH=4)稀释后，和Bioprocessor预处理过的WCX2蛋白芯片结合反应60 min，上述NaNC缓冲液清洗芯片，取出芯片风干后点50％饱和的SPA溶液，上机读片。2．2SELDI操作：SELDI质谱仪完成设置后，记录每一例样本的血清蛋白质质谱图。原始数据先用Proteinchip Software 3．1做校正，使总离子的强度及分子量均一化。用Biomarker Wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包过滤噪音局部极值的方法找出样本各自的峰，并过滤信噪比小于2的峰，以10％为最小阈值做聚类分析，得到初步筛选结果。2．3血清样本分组：组1．小儿腹部实体肿瘤组与正常对照组组2．肾母细胞瘤组与正常对照组组3．肾母细胞瘤组与其他小儿腹腔实体肿瘤组2．4建模方法：对初步筛选出来的质荷比峰做Wilconxon秩和检验，筛选每组有统计学意义的m／z值。将有显著差异的m／z值数据输入支持向量机进一步分析，用训练集建立判别模型，用测试集检验模型的效力，筛选用于建模的m／z值。评价模型的敏感性、特异性。结果1．小儿腹部实体肿瘤肿瘤组与正常对照组肿瘤组和正常对照组的质谱数据经过初步过滤筛选得到521个m／z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的m／z峰11个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的youden指数最高的组合模型，筛出m／z位于4656.5、5643.1和7777.4的蛋白质标记物3个，在肿瘤组高表达，在正常对照组低表达。联合两个潜在标记物作为输入值，留一法交叉检测，在测试集上判别模型的特异性为100.0％，敏感性为96.3％。2．肾母细胞瘤组与正常对照组肾母细胞瘤组和正常对照组的质谱数据经过初步过滤筛选得到352个M／Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M／Z峰11个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的youden指数最高的组合模型，筛出m／z位于6984.5和6455.5的蛋白质标记物2个，在肾母细胞瘤组低表达，在正常对照组高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，留一法交叉检测，在测试集上判别模型的特异性为100.0％，敏感度为100.0％。3．肾母细胞瘤组与其他小儿腹腔实体肿瘤组肾母细胞瘤组和其他小儿腹腔实体肿瘤组初步筛选出352个M／Z峰，经Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M／Z峰7个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的youden指数最高的组合模型，筛出m／z位于6914.0和3256.7的蛋白质标记物2个，在肾母细胞瘤组高表达，在其他小儿腹腔实体肿瘤组低表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法分类器评价模型的预测效果，在测试集上判别模型的特异性100.0％，敏感度93.3％。结论表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术结合支持向量机建立肾母细胞瘤血清蛋白质指纹图谱模型是早期诊断肾母细胞瘤的一种特异性强、敏感性高的新方法，可用于肿瘤患儿大规模筛查，小儿肾母细胞瘤的鉴别诊断及定性诊断。