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目的:初步阐明SET蛋白在三氯乙烯(TCE)致肝细胞毒性中的作用,为探讨SET蛋白作为TCE职业中毒效应生物标志物的可能性及揭示TCE肝细胞毒性的可能机制提供依据。方法:在课题组前期初步筛选的TCE差异蛋白基础上,选取具有重要生物学功能的差异蛋白——蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制蛋白SET,采用慢病毒介导的RNAi技术构建稳定干扰SET肝细胞株;不同浓度(0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L) TCE对L-02肝细胞进行不同时间点(6 h、12 h、24 h)处理后,利用Western Blot、实时荧光定量PCR、PP2A活性试剂盒检测不同浓度、不同时间点TCE处理L-02肝细胞后SET的表达,并探讨SET表达改变与TCE刺激肝细胞后细胞形态、细胞增殖、细胞凋亡以及SET蛋白亚细胞定位改变等指标的相互关系。结果:①测序鉴定结果表明,靶向SET的shRNA慢病毒表达载体构建成功。Western Blot和实时荧光定量PCR检测显示,psiRNA4组肝细胞干扰效果最好且稳定,对SET表达的抑制率达到90%以上。②用5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L TCE分别处理L-02肝细胞24 h后,CCK-8法显示TCE可显著抑制L-02肝细胞的增殖活性,呈明显浓度-效应关系,其对肝细胞的半数抑制浓度(IC50)为15.95 mmol/L。③Western Blot和实时荧光定量PCR结果显示,不同浓度、不同时间点TCE处理后肝细胞内SET mRNA、SET蛋白的表达均上升,其中TCE处理12 h效应最显著。而PP2A活性检测显示,不同浓度、不同时间点TCE处理后肝细胞内PP2A活性下降,进一步验证了Western Blot、实时荧光定量PCR的结果。④不同浓度(0.25、1.0、4.0 mmol/L) TCE分别处理正常肝细胞和稳定干扰SET肝细胞后,相同浓度TCE处理的正常肝细胞组和稳定干扰SET肝细胞组的细胞凋亡比较结果显示,SET表达抑制后可促进肝细胞凋亡。同时,稳定干扰SET肝细胞各组随着TCE浓度的增加,细胞凋亡率也呈现一定的上升趋势。⑤SET表达抑制后肝细胞增殖速度减慢,形态变小,边缘模糊。⑥SET蛋白表达于肝细胞核内,不同浓度TCE处理肝细胞后未导致SET蛋白的亚细胞定位发生改变。结论:①成功构建针对SET的慢病毒干扰载体,筛选出稳定干扰SET肝细胞株。②TCE对肝细胞具有细胞毒性,TCE处理24 h对肝细胞的半数抑制浓度为15.95 mmol/L。③TCE处理肝细胞后可诱导SET表达增加。④SET被抑制表达后肝细胞增殖活性下降。⑤SET蛋白可抑制肝细胞凋亡,TCE可促进细胞凋亡。⑥SET蛋白表达于肝细胞核内,TCE处理肝细胞后不会导致SET蛋白的亚细胞定位发生改变。