化疗是目前肿瘤治疗的主要方法之一，然而，化疗药物的细胞毒性在杀伤肿瘤细胞的同时还能对人体的正常组织也造成伤害，包括对女性生殖腺——卵巢的损伤。化疗引起卵巢的损伤包括卵巢功能紊乱、卵巢功能过早衰退和生殖能力下降等。已有研究显示化疗对卵巢的损害主要通过促进卵巢细胞凋亡的机制。目前保存卵巢组织和功能的措施有药物保护、胚胎冷冻保存、卵子冷冻保存、卵巢组织冷冻保存以及赠卵。但是，现有的研究表明这些技术的效果并不尽如人意。随着基因治疗在肿瘤治疗上取得的进展，我们也尝试将基因治疗运用于卵巢组织的化疗保护。在本研究中我们首次探索通过调控凋亡抑制基因在卵巢细胞中特异性表达减轻化疗对卵巢的损伤的可行性。 第一章卵巢特异性启动子OSP—2的克隆与功能检测 目的:通过分子克隆技术得到卵巢特异性启动子，并通过功能检测验证其组织特异性；然后，通过对启动子序列的分析，初步探讨卵巢特异性表达基因的调控机制。 方法: 1、分别提取卵巢组织基因组DNA和总RNA(totalRNA)； 2、依据卵巢特异性转录单位(ovarianspecifictranscriptionunits，OSTUs)序列的分析，设计特异性引物，通过RT—PCR自卵巢RNA中扩增目的片段； 3、通过TA克隆对所获得的片段进行筛选，从中得到卵巢特异性启动子OSP—2； 4、通过双酶切置OSP—2于质粒pEGFP—C2中，取代原有CMV启动子，使绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因位于启动子OSP—2的调控之下；作为阳性对照，OSP-1合成后依同法构建重组载体pOSP-1-GFP；然后将所得的两个重组载体转染各种卵巢来源和非卵巢来源细胞株，荧光显微镜下观察GFP的表达； 5、同样引物自卵巢基因组DNA中扩增目的片段，并通过TA克隆进行筛选，选取其中两个与OSP-1和OSP—2相似度最高的片段，Mutant-1和Mutant—2，通过双酶切构建重组载体pMutant-1-GFP、pMuatnt—2-GFP，然后将重组载体转染各种卵巢来源和非卵巢来源细胞株，荧光显微镜下观察GFP的表达； 6、利用TFSEARCH软件对OSP-1、OSP—2、Mutant-1、Mutant—2进行序列分析，观察启动子内是否存在卵巢特异性顺式作用元件及其变异是否与功能有关。 结果: 1、通过RT—PCR自卵巢RNA中扩增得到507bp大小的片段，TA克隆单克隆化后得到卵巢特异性启动子OSP—2； 2、重组载体pOSP-1-GFP、pOSP—2-GFP转染细胞后，在卵巢来源细胞株CHO、HO—8910、OVCAR—3均见GFP的表达，而在非卵巢来源细胞株BRL、NRK中未见GFP的表达； 3、通过PCR自卵巢DNA中扩增得到与OSP—2同样大小的片段，TA克隆后获得若干与OSP-1、OSP—2高度相似的序列，选择两个相似度最高的片段构建的重组载体转染细胞后，发现无论在卵巢来源还是非卵巢来源细胞均未见GFP的表达； 4、TFSEARCH软件分析显示，启动子序列内包含若干与卵巢生理相关的特异性顺式作用元件，如雌激素反应元件ER；在OSP-1和OSP—2内这些顺式作用元件未见突变，而在Mutant-1和Mutnat—2及其它自DNA中提取的片段内则见到大量发生在特异性顺式作用元件内和/或其邻近部位的突变。 结论: 1、利用分子克隆技术从OSTUs这一EST(expressedsequencetag，表达序列标签)中分离得到一个LRT(longterminalrepeat，长末端重复序列)样序列，功能分析表明该序列具有卵巢特异性启动子功能，由于该序列与先前已知的OSP-1具有同源性，因此命名为OSP—2； 2、序列比较显示OSP—2与克隆自大鼠基因组DNA的其它LRT样序列可能来源于同一或相近的祖先，进化过程中不同的碱基突变导致了不同的结局：OSP—2的启动子功能得以保存并获得了卵巢特异性，其余序列则功能丢失，成为JUNKDNA； 3、对OSP—2、OSP-1以及JUNKDNA中的两个成员Mutnat-1、Mutant—2的分析表明OSP—2中存在一些特异性顺式作用元件(如ER)，这些元件对维持OSP—2的卵巢特异性启动子功能具有决定性意义，其内和/或邻近部位的突变将导致功能的缺失； 4、OSP—2的克隆为进一步通过酵母单杂交等技术钓取与之特异性结合的蛋白(转录因子)奠定了基础，也为深入研究卵巢特异性基因表达调控提供了线索；另一方面，由于OSP—2功能的卵巢特异性，OSP—2有可能成为卵巢基因治疗和转基因动物模型的制备中又一得力工具。 第二章OSP—2调控Survivin在顺铂化疗中保护CHO细胞的研究 目的：利用OSP—2驱动凋亡抑制基因survivin在CHO细胞特异性表达，在体外实验中探索将基因治疗手段运用于卵巢组织的化疗保护的可行性。 方法: 1、通过酶连酶切反应构建重组载体pOSP—2-Survivin—GFP，使survivin—GFP融合蛋白直接位于卵巢特异性启动子OSP—2的调控之下； 2、重组载体pOSP—2-Survivin—GFP转染CHO细胞，经G418筛选后获得单细胞克隆，经GFP检测和survivin免疫组化验证，获得稳定表达survivin重组蛋白的CHO细胞克隆； 3、分别给予稳定转染细胞及未转染CHO细胞常规治疗剂量的顺铂化疗，通过CCK8法及流式细胞技术检测两组细胞的生长曲线及细胞凋亡率。 结果: 1、经G418筛选获得若干单细胞克隆，挑取单克隆分别培养后行荧光显微镜下GFP检测和survivin免疫组化验证，获得了稳定表达survivin重组蛋白的CHO细胞克隆； 2、给予常规治疗剂量的顺铂化疗后，稳定转染细胞和未转染细胞的生长均呈下降趋势，然而，稳定转染细胞的下降趋势明显缓于未转染细胞；在细胞凋亡的检测中也发现稳定转染细胞的凋亡率的下降趋势明显缓于未转染细胞。 结论: 1、OSP—2能够驱动凋亡抑制基因survivin在卵巢来源细胞特异性表达； 2、首次成功将survivin基因运用于化疗保护性基因治疗，并证实其能通过抑制顺铂诱导细胞凋亡的机制减轻化疗对细胞造成的损伤； 3、首次尝试将化疗保护性基因治疗应用于卵巢保护，并通过体外实验证实其可行性，为进一步体内实验打下了基础。