1.研究背景 目前HBV感染慢性化的确切机制尚不明确。HBV特异性T细胞功能低下可能是HBV感染慢性化的主要原因之一，而负性共刺激信号可导致T细胞功能低下。PD-1/PD—L1是重要的负性共刺激信号，是目前研究的热点之一。 PD-1是免疫球蛋白超家族中一员，主要诱导性的表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞表面。现有少量研究报告显示，在慢性HCV感染和慢性HIV感染患者中，病毒特异性CD8+T细胞表面的PD-1表达水平增加，且表达PD-1的T细胞比例、细胞表面PD-1表达水平与血清中的病毒载量有明显的相关性。阻断PD-1/PD—L1信号通路后T细胞数量和功能可得到一定程度恢复。PD-1与慢性HBV感染的相关性研究目前少见报道。 2.研究目的 探讨慢性乙型肝炎患者PD-1表达与HBV DNA水平和HBeAg状态的关系以及抗病毒治疗过程中PD-1表达的变化与意义。 3.对象和方法 3.1研究对象和方法本研究包括三部分。 第一部分：检测137例CHB患者和10名健康对照者PBMC上PD-1、PD—L1表达，对其中43例慢性HBV患者检测HBV基因型、22例患者行肝穿刺活检术。比较不同临床类型、不同肝组织病变程度、不同HBV基因型患者间PBMC上PD-1、PD—L1表达的差异。 第二部分：检测64例HLA—A2阳性CHB患者HBV特异性CD8+T细胞占总的CD8+T细胞比例及其PD-1表达，检测PBMC体外培养上清液IFN—γ水平。 第三部分：10例HLA—A2阳性、HBeAg阳性CHB患者应用替比夫定抗病毒治疗，分别于抗病毒治疗前、治疗12周、24周时检测：①PBMC上PD-1、PD—L1表达；②HBV特异性CD8+T细胞数量及其PD-1表达；③PBMC体外培养上清液IFN—γ水平。 3.2检测方法 3.2.1 PBMC的分离密度梯度离心法分离PBMC。 3.2.2流式细胞仪检测应用流式细胞仪技术检测HLA—A2型别、PBMC上PD-1/PD—L1的表达、HBV特异性CD8+T细胞及其PD-1表达。 3.2.3 HBV特异性CD8+T细胞富集取新鲜分离的PBMC，加入HBcAg及IL-12刺激培养7天，于第三天加入IL—2，收集悬浮细胞，应用流式细胞仪检测HBV特异性CD8+T细胞。 3.2.4 IFN—γ的检测Elisa检测PBMC体外培养上清液IFN—γ浓度。 3.2.5 HBV基因型检测采用多对型特异性引物巢式PCR法。 4.结果 4.1 PBMC上PD-1、PD—L1的表达 4.1.1 PD-1、PD—L1在慢性HBV感染不同临床类型及健康人表达的比较 病毒性肝炎(乙型)慢性(轻度)、中度、重度患者分别为51、21、30例，乙肝肝硬化(活动期，失代偿期)患者25例，重型肝炎患者10例，健康对照10例，健康对照组PBMC上PD-1表达低于慢性HBV感染患者(P<0.05)，慢性HBV感染不同临床类型间PD-1和PD—L1表达无统计学差异。 4.1.2 PBMC上PD-1、PD—L1表达与肝脏炎症活动度及纤维化分期的相关性 对22例CHB患者行肝穿刺活检术，肝组织炎症活动度共分1、2、3、4四级，各级分别有3、9、6、4例，纤维化程度分0、1、2、3、4五期，各期分别有3、4、6、7、2例。不同炎症活动度及纤维化程度患者PBMC上PD-1、PD—L1表达无统计学差异。 4.1.3 PBMC上PD-1、PD—L1表达与HBeAg状态的关系 HBeAg阳性CHB患者83例、阴性CHB患者54例，HBeAg阳性和阴性患者PBMC上PD-1表达分别为54％±17％、52％±21％，PD—L1的表达分别为40％±17％、37％±18％，两组间PBMC上PD-1、PD—LI的表达无统计学差异(P>0.05)。对于HBeAg阳性患者，HBeAg水平(以COI为单位)与PBMC上PD—L1表达成正相关(r=0.296，P=0.018)。将HBeAg阳性CHB患者按HBeAg水平(COI)分为1-500、501-1000、>1000三组，各组分别有33、12、18例患者，三组PBMC上PD-1表达分别为52％±17％、54％±15％、58％±18％，PD—L1表达分别为54％±17％、39％±16％、45％±13％，各组间PBMC上PD-1、PD—L1表达无统计学差异。 4.1.4 PBMC上PD-1、PD—L1表达与HBV DNA的关系 按HBV DNA水平(以对数级表示)将研究对象分为<3 log10、3-6log10、>6log10三组，各组分别有22、47、68例患者，三组PBMC上PD-1表达分别为59％±12％、53％±18％、54％±17％，PD—L1的表达分别为41％±13％、34％±17％、41％±18％，各组间PBMC上PD-1表达无统计学差异；>6log组PBMC上PD—L1表达高于3-6log组(P=0.039)；PBMC上PD-1、PD—L1的表达与HBV DNA水平无相关性。 4.1.5 PBMC上PD-1/PD—L1表达与HBV基因型的关系 对43例慢性HBV患者进行HBV基因型检测，其中A、B、C、D、BC混合型分别为1、20、17、2、3例，各HBV基因型感染者间PBMC上PD-1、PD—L1的表达无统计学差异。 4.2 HBV特异性CD8+T细胞数量及其PD-1的表达 4.2.1 HBV特异性CD8+T细胞与PBMC的PD-1表达比较 HBV特异性CD8+T细胞中表达PD-1的细胞比例(75％±13％)高于PBMC(56％±16％)，两者差值比较有统计学意义(P<0.001)，且两者之间存在正相关(r=0.325，P=0.03)。 4.2.2 HBV特异性CD8+T细胞数量与其PD-1表达的相关性 HBV特异性CD8+T细胞数量与其PD-1表达成负相关(r=—0.29，P=0.02)。 4.2.3不同临床类型CHB患者HBV特异性CD8+T细胞PD-1表达和IFN—γ水平 肝硬化(3.1％±1.6％)与重型肝炎(3.3％±1.7％)患者HBV特异性CD8+T细胞数较慢性乙型肝炎轻、中、重度(分别为1.7％±0.7％、1.6％±1.5％、1.5％±1.2％)高(P<0.05)。不同临床类型患者HBV特异性CD8+T细胞PD-1的表达无统计学差异。重型肝炎组(156±92)和肝硬化组(100±140) PBMC细胞培养上清液IFN—γ(pg/ml)水平较慢性乙型肝炎轻、中、重度(分别为81±16、71±23、73±90)高，但无统计学意义。 4.2.4 HBV特异性CD8+T细胞数量及其PD-1表达与HBV DNA水平及HBeAg状态的关系 HBV特异性CD8+T细胞数量与HBV DNA水平成负相关(r=—0.273，P=0.013)，与HBV特异性CD8+T细胞PD-1的表达成正相关(r=0.272，P=0.046)。HBeAg阳性与阴性患者HBV特异性CD8+T细胞数量分别为1.8％±1.0％、2.1％±1.6％，其PD-1的表达分别为74％±11％、78％±10％，均无统计学差异(P>0.05)。HBeAg阴性患者PBMC细胞培养上清液IFN—γ水平(147pg/ml±87pg/ml)较HBeAg阳性患者(89pg/ml±81pg/ml)高(P=0.023)。 4.3.HBeAg阳性患者替比夫定抗病毒治疗前后PD-1表达的变化 治疗24周时，PBMC上PD-1、PD—L1表达、HBV特异性CD8+T细胞PD-1表达较治疗前的平均下降值分别为29.4％、23.9％、28.6％。2名发生HBeAg血清学转换患者PBMC上PD-1、HBV特异性CD8+T细胞PD-1平均下降值分别为48.5％、40.5％，较未发生血清学转换者下降明显(分别为24.6％、25.6％)。 5.结论 5.1慢性HBV感染者PD-1的表达明显高于正常人。PD-1表达与HBV DNA水平正相关。PD-1表达与HBeAg状态、HBV基因型及肝脏病变程度无明显相关。 5.2替比夫定抑制HBV DNA复制，可使PD-1表达水平下降，部分恢复HBV特异性T细胞功能。 5.3替比夫定治疗过程中PD-1表达快速下调是否对早期HBeAg血清学转换有预测作用值得进一步研究。