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第一部分CBZ对斑马鱼胚胎血管发生和神经发育的影响目的研究卡博替尼（cabozantinib,CBZ）对血管发生和神经发育的影响方法斑马鱼胚胎是通过斑马鱼自然交配方式而获得。转基因斑马鱼线品系Tg（Flk:mcherry::Hb9:EGFP）在Flk（血管内皮细胞标记物）调控下表达单节显性樱桃色（monomeric cherry,mcherry 红色）,在同源框 9（homeo box 9,Hb9;运动神经元的标记物）的调控下表达增强的绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP;绿色）。另一种转基因斑马鱼线品系Tg（Flk:EGFP）,在Flk调控下表达EGFP（绿色）。在斑马鱼受精后6小时（hours post-fertilization,hpf）,在光学显微镜下筛选合格胚胎,去除发育畸形及形态异常的胚胎个体。将10个无畸形、无发育异常的胚胎装入含有E3溶液的96孔板中。在8 hpf时,用不同浓度的CBZ处理溶液（0.01、0.1、1、5、10、50、100和500μg/ml）替换E3溶液。在48 hpf,收集斑马鱼胚胎,剥除斑马鱼胚胎的绒毛膜,然后将胚胎固定于低熔点的琼脂糖中,利用共聚焦显微镜观察斑马鱼胚胎体节间血管（intersegmental blood vessels,ISV）、运动神经元以及脑部及眼部血管的形态。结果使用不同浓度的 CBZ 溶液（0.01、0.1、1、5、10、50、100、500 或 500 μg/ml）从8 hpf到48 hpf处理野生型（wild type,WT）斑马鱼胚胎。浓度超过5 μg/ml的CBZ处理会导致畸形、发育迟缓和死亡等表型。在以下实验中选择0.1 μg/ml、1 μg/ml和5 μg/ml作为工作浓度,验证CBZ对斑马鱼胚胎血管生成和神经发育的影响。结果表明,以0.1 μg/ml、1μg/ml和5μg/ml的CBZ可显著抑制斑马鱼胚胎脑和眼血管发育,同时ISV长度明显缩短,ISV缺失率呈剂量依赖性增加。但CBZ处理不会导致斑马鱼胚胎的神经发育受损。结论CBZ抑制斑马鱼胚胎体节间、头部及眼部血管生成,而不影响神经发育。第二部分CBZ对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管生成的影响目的研究CBZ对小鼠激光诱导的脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）的作用及机制。方法用C57BL/6J小鼠通过氪离子激光光凝术构建小鼠CNV模型,将小鼠随机分为正常组、空白组、卡博替尼（不同浓度）组和雷珠单抗（ranibizumab,RBZ）组。蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB）检测各组视网膜-视网膜色素上皮层（retinal pigment epithelium,RPE）-脉络膜组织中肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、磷酸化肝细胞生长因子受体（phosphorylated hepatocyte growth factor receptor,p-MET）、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor,MET）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、磷酸化血管内皮生长因子受体2（phosphorylated vascular endothelial growth factor receptor 2,p-VEGFR2）、血管内皮生长因子受体 2（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2）及其下游通路分子磷酸化信号转导子和转录激活子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3）、信号转导子和转录激活子 3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）、磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B,p-AKT）、蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）、磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK 1/2）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2）的蛋白水平;脉络膜铺片及免疫荧光染色检测CNV建模7天的p-MET和p-VEGFR2的表达;从建模后第3天到第7天,采用玻璃体腔注注射的方法给予CBZ,眼底荧光血管造影（fundus fluorescein angiography,FFA）和吲哚菁绿血管造影（indocyanine green angiography,ICGA）分别检测CBZ对小鼠CNV渗漏和损伤面积的影响;苏木素-伊红（haematoxylin-eosin,HE）染色及免疫荧光检测视网膜厚度,分析CBZ对视网膜组织形态是否具有毒性;终端 dUTP 缺口标记（terminal dUTP nick-end labeling,TUNEL）检测 CBZ 玻璃体腔注射后的小鼠视网膜细胞的凋亡;从建模后的第0天到第14天,采用灌胃法给予小鼠CBZ,FFA及ICGA分别检测CNV渗漏和损伤面积,脉络膜铺片及免疫荧光检测血管内皮细胞标记同工凝集素B4（isolectin B4,IB4）和细胞骨架标记鬼笔环肽（phalloidin）的表达。结果WB结果显示在CNV建模7天后,视网膜-RPE-脉络膜组织中HGF、p-MET、VEGF、p-VEGFR2及其下游通路分子p-STAT3、p-AKT和p-ERK1/21/2的蛋白水平在第3天开始增加,第7天达到峰值,此后,HGF、p-MET和VEGF的蛋白水平下降,而p-VEGFR2的蛋白水平一直保持高水平,直到14天。免疫荧光染色结果显示,在CNV建模后第7天,p-MET和p-VEGFR2水平升高,并且与胶原蛋白I（collagenⅣ,Col-Ⅳ）共定位。玻璃体腔注射CBZ能够下调视网膜-RPE-脉络膜组织中HGF、p-MET、VEGF、p-VEGFR2 及其下游通路分子 p-STAT3、p-AKT 和 p-ERK1/2 的蛋白水平,同时减少CNV区域的渗漏和损伤面积。HE染色的视网膜厚度定量结果显示,正常和CBZ玻璃体腔内注射组的视网膜组织学形态和厚度无差异。CBZ灌胃给药后CNV区域的渗漏和损伤面积减小。结论 CBZ 下调 HGF、p-MET、VEGF、p-VEGFR2 及其下游通路分子 p-STAT3、p-AKT和p-ERK1/2的表达,减缓激光诱导的小鼠CNV区域的渗漏及损伤面积,抑制CNV生成,研究结果将为湿性年龄相关性黄斑变性（wet Age-related macular degeneration,wet AMD）患者提供一种新的潜在治疗方法。第三部分CBZ对缺氧条件下小鼠脑微血管内皮细胞直接作用及机制目的检测CBZ对缺氧条件下小鼠脑微血管内皮细胞生物学行为的影响,探讨CBZ影响新生血管的细胞及分子机制。方法培养小鼠脑微血管内皮细胞株B-End3细胞,建立体外B-End3细胞缺氧模型;WB检测B-End3细胞缺氧模型中p-MET、p-VEGFR2及其下游通路分子p-STAT3、p-AKT 和 p-ERK1/2 的蛋白水平;5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）掺入实验及细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）实验检测CBZ对B-End3细胞增殖的影响,Transwell迁移及划痕实验检测CBZ对B-End3细胞迁移的影响,体外管腔形成实验检测CBZ对内皮细胞管腔形成的影响。结果与常氧组相比,B-End3细胞缺氧模型中p-MET、VEGF、p-VEGFR2及其下游通路分子p-STAT3、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平增高。与低氧组相比,CBZ处理组中 p-MET、VEGF、p-VEGFR2 及其下游通路分子 p-STAT3、p-AKT 和 p-ERK1/21/2的蛋白水平降低。与常氧组相比,低氧组中内皮细胞细胞增殖、迁移及管腔形成能力增强。与低氧组相比,CBZ处理后内皮细胞的增殖能力减弱,迁移的细胞数量减少,管腔形成能力受到明显抑制。结论CBZ抑制B-End3细胞中MET及VEGFR2信号通路,降低B-End3细胞增殖、迁移和管腔形成,抑制新生血管的形成。