论文部分内容阅读
目的:肿瘤微环境是指肿瘤局部浸润的间质细胞（包括巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等）及其分泌的活性介质与肿瘤细胞共同构成的局部内环境。其中数量最多的是肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）。根据表型和功能,巨噬细胞可被分为2类。许多研究表明肿瘤相关巨噬细胞表现为M2型。它能够促进肿瘤生长;参与间质重塑,促进肿瘤浸润;促进新生血管形成;促进淋巴管形成;参与肿瘤的免疫抑制。鉴于TAMs的细胞学功能,清除肿瘤微环境中的TAMs可以达到抗肿瘤的作用。CD163是血红蛋白清道夫受体,在单核巨噬细胞系统特异性表达,并被认为是一种高特异性的M2型巨噬细胞标志物。由于稳定性高,毒作用小且具有良好的吸光性,金纳米颗粒（gold nanoparticles,Au NPs）可以作为光声材料。金颗粒在接受近红外段激光辐照后产生的表面等离子共振效应（surface plasmon resonance,SPR）,不仅能产生强烈的光散射,而且可以促进液态氟碳发生相变。因此,金纳米颗粒在肿瘤的成像和治疗中得到了广泛的研究。金纳米棒（gold nanorods,GNRs）是一种棒状金纳米颗粒,它具有丰富的物理化学性质,在生物医学方面具有广泛应用。GNRs与多肽、叶酸和抗体的结合增强了其靶向能力。光热疗法（photothermal therapy,PTT）越来越受到重视,它主要利用近红外（near-infrad,NIR）激光的组织高穿透力。金纳米粒子在NIR激光照射下能有效杀伤肿瘤细胞。因此,功能化修饰的金纳米棒在光热条件下可以靶向杀伤TAMs,进而起到了治疗肿瘤的作用。研究方法:1、制备靶向TAMs的金纳米颗粒:利用CD163单克隆抗体和金纳米棒制备出靶向肿瘤相关巨噬细胞的金纳米颗粒（m Ab-CD163/Au）;对m Ab-CD163/Au进行物理表征;利用流式细胞术验证金纳米棒与CD163单克隆抗体的偶联;应用NIR激光照射不同浓度的m Ab-CD163/Au溶液,分别于各时间点记录每组溶液的温度情况。2、体外环境中靶向杀伤TAMs产生的抗肿瘤效应:利用佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）及白介素4（Interleukin 4,IL-4）将人单核细胞系THP-1细胞诱导分化成M2型巨噬细胞,并采用流式细胞术进行表型验证;在M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化过程中,通过实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）和Western Blot检测肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ）和CD163在m RNA水平及蛋白水平的表达变化。制备M2型巨噬细胞爬片,通过双光子显微镜成像观察m Ab-CD163/Au在巨噬细胞内的聚集情况;将不同浓度的m Ab-CD163/Au溶液分别加到M2型巨噬细胞内,通过CCK-8实验检测各浓度m Ab-CD163/Au溶液的细胞毒性。应用CCK-8实验检测不同浓度的m Ab-CD163/Au溶液NIR激光照射下对M2型巨噬细胞的杀伤情况。使用Transwell小室进行肿瘤细胞与巨噬细胞共培养,通过NIR激光照射杀伤M2型巨噬细胞,进而分析人乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的变化。3、体内环境中靶向杀伤TAMs产生的抗肿瘤效应:选用BALB/c裸鼠建立人乳腺癌MCF-7细胞移植瘤模型。当移植瘤平均直径达到5 mm时,在实验组各肿瘤的上下左右4个部位分别注射0.1 m L m Ab-CD163/Au溶液,然后经NIR激光照射。每隔2天测量一次肿瘤大小,并绘制肿瘤生长曲线。15天后处死各组裸鼠,收集各组移植瘤组织进行免疫组织化学分析并计数肿瘤周围CD163+细胞数目。结果:1、制备靶向TAMs的金纳米颗粒:经马尔文粒径仪检测,制备出的金纳米颗粒平均粒径为363 nm,溶液Zeta电位为-6.4 m V;经紫外—可见光分光光度计检测,该溶液在1064 nm附近具有吸收峰。流式细胞术结果显示制备出的金纳米颗粒表面覆盖CD163抗体。NIR激光照射时间越长,溶液温度越高;当照射时间相同时,m Ab-CD163/Au浓度越大,溶液温度越高。2、体外环境中靶向杀伤TAMs产生的抗肿瘤效应:THP-1细胞形态为圆形,内部清亮,细胞呈悬浮状态生长。经PMA作用后,细胞聚集、贴壁。再经IL-4处理,细胞呈梭形,可见伪足。流式细胞术结果显示,经PMA和IL-4诱导的THP-1细胞其表面高表达CD163分子。q PCR及Western Blot结果显示M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化过程中,TNF-ɑ在m RNA水平和蛋白水平表达降低,CD163在m RNA水平和蛋白水平表达增高。双光子显微镜成像结果显示经PMA和IL-4诱导成的M2型巨噬细胞内聚集更多的m Ab-CD163/Au颗粒。CCK-8结果显示,m Ab-CD163/Au溶液随着浓度增加,细胞毒性越大;在NIR激光照射下,m Ab-CD163/Au浓度越大,对M2型巨噬细胞的杀伤作用越大。Transwell结果显示,在NIR激光照射下通过m Ab-CD163/Au靶向杀伤M2型巨噬细胞,穿过小室的人乳腺癌MCF-7细胞数量减少,说明其侵袭能力降低。3、体内环境中靶向杀伤TAMs产生的抗肿瘤效应:在BALB/c裸鼠腋下脂肪垫处注射人乳腺癌MCF-7细胞悬液,大约5天移植瘤模型建立成功。实验组（在瘤体的上下左右4个部位分别注射m Ab-CD163/Au溶液,并经NIR激光照射）的肿瘤体积明显小于对照组。免疫组织化学结果显示,实验组肿瘤周围的CD163+细胞数目明显少于对照组。结论:1、CD163单克隆抗体修饰的金纳米颗粒对TAMs具有靶向性。2、体外环境中,在光热条件下通过靶向杀伤TAMs可以降低肿瘤细胞的侵袭能力。3、体内环境中,在光热条件下通过靶向杀伤TAMs可以抑制肿瘤的生长。