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氮是植物生长发育所必需的大量营养元素。豆科植物能与根瘤菌共生形成固氮器官—根瘤,从而固定空气中的氮气为植物提供可利用的氮源。共生固氮是多基因控制的数量性状,其过程主要包括根瘤菌的侵染、根瘤原基的形成以及固氮根瘤的发育,这些过程均受到微生物与宿主的严格调控,然而其具体的遗传分子机制仍不十分清楚。根瘤原基的膨大发育对形成根瘤和高效固氮至关重要,但国内外在调控根瘤发育方面的研究进展较为缓慢,其主要遗传分子调控机制尚未被阐明。本研究利用正向遗传学手段定位到大豆(Glycine max)中控制根瘤大小的重要QTL(Quantitative trait locus)位点,克隆了候选基因INCREASING NODULE SIZE1(GmINS1),并对其进行了功能分析,主要研究结果如下:(1)本研究利用已建立遗传图谱的P1×P2大豆重组自交系(Recombinant inbred lines,RILs)群体为材料,对大豆结瘤相关性状进行QTL定位分析,发现了1个控制根瘤大小的QTL位点:qBNF-11,通过候选基因预测及筛选,获得并克隆了qBNF-11中控制根瘤大小的主效基因INCREASING NODULE SIZE1(GmINS1)。(2)生物信息学分析表明:GmINS1属于大豆β-扩张蛋白家族,编码细胞壁扩张蛋白,该家族在大豆中共有9个成员。GmINS1与实验室前期研究发现的参与调控大豆结瘤的扩张蛋白GmEXPB2属于同一扩张蛋白家族,两者之间表现出78%的氨基酸序列相似性。(3)定性PCR检测发现P1和P2两个亲本在GmINS1启动子区域中存在4个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)。基于GUS酶活性和启动子区段分析发现,亲本P2基因型中包含的SNP A/C对GmINS1表达具有显著影响。在亲本、40个来自亲本的RILs和40个选自大豆核心种质资源库的材料中,包含SNP C的P2基因型的GmINS1启动子能显著增强GmINS1的转录水平并促进根瘤发育。说明GmINS1的表达与根瘤发育显著相关。(4)组织化学定位结果表明:GmINS1基因在根瘤快速发育阶段高度表达。GmINS1启动子驱动GUS的染色结果发现该基因主要在根瘤组织的维管束、皮层和薄壁细胞中表达。说明GmINS1可能主要参与调控根瘤膨大发育过程。(5)GmINS1在根瘤发育过程中的生物学功能研究结果表明:GmINS1的过量表达能显著增加大根瘤的数目、重量和侵染细胞的数目、大小,并提高根瘤的固氮酶活性,进而改变了大豆植株的生物量和氮含量。而RNA干涉抑制GmINS1的表达则会显著抑制根瘤的发育,导致大根瘤数目、重量和侵染细胞数目、大小都显著减少并且根瘤固氮酶活性显著降低。(6)扩张蛋白在豆科植物的结瘤过程中发挥重要作用,对于依靠细胞扩张膨大来完成发育的有限型根瘤来说更是必不可少。生物学功能研究结果表明:双重干涉GmINS1和GmEXPB2显著抑制大豆结瘤过程,其中大根瘤数目、重量,单个根瘤大小,根瘤内侵染细胞的发育和根瘤固氮酶活性都受到显著抑制。综上所述,本研究通过图位克隆获得了控制根瘤大小的候选基因GmINS1。发现GmISN1编码细胞壁β-扩张蛋白,是调控根瘤发育的关键基因;GmINS1和GmEXPB2能协同调控大豆的结瘤过程。研究结果为通过分子育种途径,培育高效固氮的大豆新品系提供了理论依据和候选基因。