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背景:甲状腺相关眼病(Thyroid-associated ophthalmopathy,TAO),是最常见的眼眶疾病,是一种自身免疫性疾病,临床表现主要为因眶内免疫及增殖反应而导致的突眼、眼球运动障碍、压迫性视神经病变等。近年来,由于生活节律及社会环境的改变,TAO由于其发病机制仍不明确,且尚无特效治疗方法,严重影响患者的工作和生活,更有部分患者因TAO而失明。探讨TAO的发病机制,研发针对TAO的靶向治疗,是重要的研究课题。目前研究表明:CD4+T细胞参与的免疫反应,在TAO的发生、发展中起重要作用。MicroRNA(miRNA)是调控免疫细胞发育以及免疫应答的重要因子。miR-146a可抑制T细胞的活化,负向调控免疫反应,同时参与调节细胞增殖、分化等许多生命过程。在前期研究中我们发现:miR-146a在TAO患者眼眶组织及外周血单个核细胞(PBMC)中低表达。但miR-146a在TAO患者CD4+T细胞水平,以及作用尚不明确。miR-146a具有多个靶基因,为典型多功能miRNA,在同一细胞通路中依据不同的条件而发挥各自特征性的调节作用。miR-146a针对TAO的免疫调节具有多个潜在作用靶点。MicroRNA(miRNA)为动植物体内由21-25个核苷酸组成的单链小分子非编码RNA。CD4+T细胞参与的免疫反应,是甲状腺相关眼病(TAO)发生的重要因素。研究表明:miR-146a抑制T细胞的活化,负向调控免疫反应;且参与细胞增殖分化等过程。我们在前期研究中发现:miR-146a在TAO眶组织中低表达。但miR-146a在TAO患者CD4+T细胞的水平,以及它们的作用及机制尚不明确。目的:探讨在活动期TAO患者CD4+T细胞中miR-146a的表达水平,搜寻NUMB为miR-146a的靶分子,并且探讨miRNA-146a的改变对其靶基因的影响。探讨在过表达miRNA-146a对正常人或活动期TAO患者中的生物学效应。研究抑制miRNA-146a表达对正常人或活动期TAO患者自身免疫反应的影响,探讨miRNA-146a表达在NF-KB信号通路调控作用。方法:抽取活动期TAO患者或正常人外周静脉血,采用密度梯度离心法分离外周血CD4+T细胞,运用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测miR-146a的表达水平。运用生物信息学方法查找miR-146a在CD4+T细胞中的潜在靶分子,搜寻与TAO发病过程密切相关的基因查找到NUMB为miR-146a的潜在靶分子;运用双荧光素酶报告基因系统检测miR-146a对靶分子的表达调控。采用密度梯度离心法分离外周血CD4+T细胞,然后进行细胞转染,将miR-146a模拟物(miR-146a mimic)、miR-146a抑制物(miR-146a inhibitor)、BLANK或者阴性对照(Negative control)使用INTERFERin非脂质体阳离子两性分子转染试剂瞬时转染至正常人CD4+T细胞;将miR-146a模拟物、miR-146a抑制物、BLANK或者阴性对照(Negative control)使用INTERFERin非脂质体阳离子两性分子转染试剂转染至活动期TAO患者CD4+T细胞;提取总RNA采用实时定量聚合酶链反应和采用蛋白免疫印迹(Western Blot)检测。NUMB蛋白表达水平,采用密度梯度离心法分离外周血CD4+T、B细胞;分别进行细胞转染模拟物和抑制物以后,ELISA方法检测CD40L表达;细胞增殖实验采用CCK8试剂盒检测CD4+T细胞增殖水平;检测TGF-β、IL10表达水平;检测IgG抗体表达水平。PCR检测肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)mRNA表达的表达水平。蛋白免疫印迹(Western Blot)检测坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)蛋白表达水平,阐明miR-146a表达在NF-KB信号通路调控作用。结果:活动期TAO患者CD4+T细胞miR-146a表达与正常对照组相比下调搜寻到可能与TAO发病过程密切相关NUMB基因为靶基因,转染miR-146a模拟物正常人CD4+T细胞miR-146a水平表达增高,蛋白NUMB水平下调。转染miR-146a抑制物正常人CD4+T细胞miR-146a水平表达降低,蛋白NUMB水平上升。转染miR-146a模拟物活动期TAO患者CD4+T细胞miR-146a水平表达增高,NUMB蛋白水平下调。转染miR-146a抑制物活动期TAO患者CD4+T细胞miR-146a水平表达降低,蛋白NUMB水平上升。与正常对照组相比较,活动期TAO患者CD4+T细胞的NUMB蛋白表达水平升高。过表达实验中的正常人CD4+T细胞中低水平CD40L表达,细胞增殖活性减弱,TGF-β、IL10细胞因子表达降低,自身B细胞IgG抗体产生水平降低;转染模拟物的活动期TAO患者CD4+T细胞出现CD40L表达下降,细胞增殖活性减弱,TGF、IL10细胞因子表达降低,自身B细胞IgG抗体产生水平降低;在抑制表达实验中的正常人CD4+T细胞中水平CD40L表达水平上升,细胞增殖活性增强,TGF-β、IL10细胞因子表达增高,自身B细胞IgG抗体产生水平增高;转染抑制物的活动期TAO患者CD4+T细胞出现CD40L表达增高,细胞增殖活性增强,TGF、IL10细胞因子表达增高,自身B细胞IgG抗体产生水平增高;转染miRNA-146a模拟物的正常人CD4+T细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)mRNA水平表达无明显差异,蛋白水平降低。转染miRNA-146a模拟物的活动期TAO患者CD4+T细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)mRNA表达水平无明显差异,蛋白水平降低。转染miRNA-146a抑制物的正常人CD4+T细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)mRNA水平表达无明显差异,蛋白水平升高。转染miRNA-146a抑制物的活动期TAO患者CD4+T细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)mRNA表达水平无明显差异,蛋白水平升高。结论:miR-146a靶基因NUMB在活动期TAO患者CD4+T细胞的表达增高。活动期TAO患者CD4+T细胞中低表达miR-146a。NUMB为miR-146a的靶基因。miR-146a过表达可以降低正常人CD4+T细胞NUMB蛋白表达水平;抑制miR-146a表达可以增高正常人CD4+T细胞NUMB蛋白表达水平;miR-146a过表达可以降低活动期TAO患者CD4+T细胞NUMB蛋白表达水平;抑制miR-146a表达可以增高活动期TAO患者CD4+T细胞NUMB蛋白表达水平;过表达miR-146a对正常人或活动期TAO患者CD4+T细胞抑制自身免疫反应。抑制miR-146a表达对正常人或活动期TAO患者CD4+T细胞促进自身免疫反应。过表达miR-146a在CD4+T细胞中NF-KB信号通路中可能发挥抑制作用。抑制miR-146a表达在CD4+T细胞中NF-KB信号通路中可能发挥激活作用。