论文部分内容阅读
研究背景及目的:Wnt/β-catenin信号通路是骨形成过程中最关键的信号通路,在体内运用PI3K/AKT GSK-3β信号通路的抑制剂(LY294002和TWS119)以验证PI3K/AKT GSK-3β信号通路在2型糖尿病大鼠主动脉钙化中的作用。研究方法:(1)将购买的SD大鼠80-100g(60只)饲养在动物房内。饲养一周待大鼠熟悉环境、温度及饲料后,随机分为N组、DM组、DMSO组、LY294002组、TWS119组,每组各12只SD大鼠,并且每组分别给予不同饲料喂养。N组(12只大鼠)用普通饲料喂养4周,DM组、DMSO组、LY294002组、TWS119组(共计48只大鼠)用高脂饲料(HFD)喂养4周。4周后,测得空腹血糖及体重(记录为0天)。测得数据后,将DM组、DMSO组、LY294002组、TWS119组(共计48只大鼠)腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建2型糖尿病大鼠模型。腹腔注射STZ后的第3、5、7、14、28天,分别对大鼠采集随机血糖,5次测量中≥3次大鼠血糖浓度>16.6 mmol/L即可判定为糖尿病大鼠模型成功。糖尿病模型未成功的大鼠再予以少剂量STZ腹腔追加注射。(2)2型糖尿病大鼠模型造模成功后,N组大鼠予以10ml/kg生理盐水腹腔注射;DM组大鼠同样予以10ml/kg生理盐水腹腔注射;DMSO组大鼠予以10ml/kg二甲基亚砜(DMSO)腹腔注射;LY294002组大鼠予以AKT抑制剂LY294002按照60mg/kg剂量腹腔注射;TWS119组大鼠予以GSK-3β抑制剂TWS119按照30mg/kg的剂量腹腔注射。以上溶剂均为每天下午注射,持续3周。(3)在SD大鼠体内连续腹腔注射PI3K/AKT GSK-3β信号通路的抑制剂(LY294002及TWS119)1月后,脱颈处死全部大鼠后,立即用5ml空针行心脏抽血,并立刻离心取上清液分装于EP管中,标记好分组后保存于-20℃冰箱暂存。再取大鼠主动脉拟行动脉钙化的大体分析:病理切片的Von Kossa染色、病理切片的弹性纤维染色、病理切片的免疫组化检测β-catenin的表达、主动脉组织钙含量测定和成骨相关蛋白(Runx2、OPG及BMP2)和β-catenin通路信号蛋白表达的检测;运用到的相关检测技术包括Western Blot检测分析、免疫组化分析、Von Kossa钙化染色、弹性纤维染色等。实验结果:(1)高脂饲料(HFD)+腹腔注射链脲佐菌素(STZ)能成功构建2型糖尿病大鼠模型。(2)在体内运用PI3K/AKT抑制剂LY294002后,可以降低大鼠主动脉钙含量、钙化及胶原蛋白的表达,弹性纤维破坏减少,完整性增加。(3)在体内运用GSK-3β抑制剂TWS119后,可能是通过激活wnt/β-catenin信号通路,上调成骨相关蛋白Runx2、OPG及BMP2等的表达来促进大鼠主动脉的钙化。结论:(1)PI3K/AKT GSK-3β信号通路参与了2型糖尿病大鼠主动脉的钙化,并且可能是通过调控β-catenin转录活性来发挥作用。(2)通过糖尿病大鼠体内实验,验证了PI3K/AKT GSK-3β/β-catenin信号通路或许可以作为预防和治疗糖尿病动脉钙化的新靶点。