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莪术(CURCUMAE RHIZOMA)为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或温郁金 Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。后者习称“温莪术”。莪术为常用中药,国内需求量较大,同时大量出口东南亚、日本、美国等地。本文综合应用了传统鉴定方法和DNA条形码技术相结合的手段对三种不同来源的莪术进行研究,并对其质量进行综合评价,从而为莪术的开发利用提供依据。 目的: 莪术作为多来源的药材,临床使用十分混乱。其不同来源药材的外观性状相近,就连一些专家学者都难以分辨,国内学者对其分种问题也一直存在着争议。鉴于莪术市场存在的来源不明等情况比较严重,有必要建立基于DNA条形码的莪术鉴别体系,对传统鉴定加以补充。对不同来源的莪术进行质量监控,明确不同来源莪术的化学成分差异,以更好地指导莪术的临床应用。 方法: 1.传统的基原鉴定及性状鉴定:参照《中国植物志》、《中国药典》,结合药材的性状鉴定,根据专家鉴定结果,初步判断来源。 2.DNA条形码鉴定:采用CTAB法、试剂盒法提取基因组总DNA,以ITS2,psbA-trnH做为通用引物,运用2*PCR MIX试剂盒进行PCR扩增,产物经测序后得到序列,通过Codon Code Aligner4.2.5、Mega6.05等软件对测序后的序列进行系统分析,考察不同种之间的亲缘关系,建立莪术组植物的分子鉴定方法。 3.常规检查:根据《中国药典》(2010年版一部)莪术项下对所收集样品进行常规项检查,为后续的实验结果提供基础数据及依据。 4.气相色谱分析:运用GC测定法,参考文献,并加以改进,建立了莪术GC指纹图谱的研究方法。绘制其指纹图谱,进行比对、研究;并运用聚类分析统计方法对结果加以讨论。 结果: 1.传统的基原鉴定及性状鉴定:经专家鉴定莪术样品分别为蓬莪术、广西莪术、温郁金的原植物及干燥根茎,确定了其基原。 2.DNA条形码鉴定:CTAB法和试剂盒法均能从莪术中提取到足够量的基因组DNA用于PCR的扩增,ITS2、psbA-trnH引物扩增产物经过测序,结果表明ITS2基因间隔区序列存在大量简单重复序列,造成结合、杂合问题,因此选用psbA-trnH序列进行莪术鉴定,并建立了莪术系统进化发育树。 3.常规检查:对莪术进行检查,结果表明灰分测定及浸出物测定项均符合规定,而水分测定项及挥发油测定项有部分样品不符合规定。 4.气相色谱分析:用建立的色谱条件,测定得到的莪术GC图谱,共有15个共有峰,其中指认了4个色谱峰。共有峰的相对峰面积RSD均小于3%,12批的莪术指纹图谱相似度为0.478-0.912;聚类分析结果较好,能将不同产区的莪术聚在一起。 结论: 1.传统的基原鉴定及性状鉴定:传统的鉴定较为困难,需经专业人士的综合判断方能确定其基原。 2.DNA条形码鉴定:ITS2序列暂无法获得成功序列,未能构建发育树。成功获得了psbA-trnH序列,构建了莪术组植物的亲缘关系系统发育树,并对其遗传多样性进行分析。 3.常规检查:对莪术作常规检查,除部分批次水分超出限度外,其余均符合规定。但是不同批次的挥发油含量相差较大。 4.气相色谱分析:通过对各种莪术的图谱进行分析,结果表明不同种间相似度较低,而聚类结果表明不同来源的莪术能聚为一系,表现出高度地域性。