论文部分内容阅读
目的：利用网络药理学和生物信息学GEO芯片预测黄芩汤治疗溃疡性结肠炎小鼠的有效成分、潜在靶点和代谢通路，通过分子生物学技术和16s rDNA测序技术检测黄芩汤治疗溃疡性结肠炎小鼠的作用机制和对肠道菌群的影响。
方法：利用TCMSP数据库筛选黄芩汤四味药材的有效成分和作用靶点，在GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库以及GEO数据库筛选疾病基因信息，对疾病与中药成分靶点绘制韦恩图并构建PPI网络，用R4.0.4软件和Cytoscape3.8.0软件中的CytoNCA和BisoGenet进行筛选和拓扑分析并构建网络，用R语言进行GO、KEGG富集分析及KEGG关系网络构建，最终得到黄芩汤治疗溃疡性结肠炎的主要有效成分、核心靶点以及代谢通路。采用葡聚糖硫酸钠构建溃疡性结肠炎小鼠模型并在行为学、体重变化、粪便隐血测试、疾病活动指数、结肠组织形态观察及结肠组织病理学检查等方面进行模型评价。模型建立后将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、黄芩汤高剂量组、黄芩汤中剂量组和黄芩汤低剂量组，给药治疗21d后收集各组小鼠结肠组织，观察结肠组织形态学病变情况，HE染色进行结肠组织病理学检查、免疫组化检测结肠组织中IL1β、IL6、IL10和TGFβ细胞因子含量变化，采用16s rDNA测序技术检测各组小鼠肠道菌群变化，以此来研究黄芩汤对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用、炎症因子的变化以及对肠道菌群的影响。
结果：网络药理学和生物信息学共同检索结果得到黄芩汤中165个有效成分，主要包括黄酮类、生物碱、萜类等，相关靶点有2836个，160个交集靶点，GEO数据库筛选得到910个差异基因，其中实验组上调基因575个，下调335个。经“有效成分-UC靶点”网络的构建获得连接疾病节点数目最多的成分为槲皮素、汉黄芩素、刺槐素、山奈酚、柚皮素，PPI网络构建得到IL6、IL1β、FOS、STAT3等关键因子，GO和KEGG富集分析及KEGG网络构建得知黄芩汤治疗溃疡性结肠炎主要在TNF和IL17等信号通路上富集，核心基因为IL6、IL1β、FOS、JUN等。经动物实验可知，黄芩汤可改善模型小鼠精神状态等行为学特征，降低粪便隐血测试阳性表达，提高小鼠体重。阳性药物组、黄芩汤治疗组结肠长度较模型组显著上升，黄芩汤中剂量组结肠组织颜色趋于正常，长度最接近空白组，HE染色可观察到黄芩汤中剂量组与阳性药和黄芩汤高剂量组比，炎性细胞明显减少，腺体排列较为规则，免疫组化得知空白组与模型组IL6、IL10有显著性差异（P＜0.01），IL1β有统计学意义，与空白组比较，模型组IL1β、IL6含量显著上升、IL10含量显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩汤高中低剂量组IL1β显著下降（P＜0.05）黄芩汤中剂量组IL1β含量最少，阳性药、黄芩汤中剂量组IL6显著下调（P＜0.01），阳性药、黄芩汤高、中剂量组IL10显著上调（P＜0.01），高剂量组含量最多，其次是低剂量组、高剂量组、阳性药物组；各组中TGFβ含量无显著性差异（P＞0.05）。通过16s rDNA技术测得2705010条肠道菌群序列，物种分类学显示模型组中拟杆菌门、变形菌门丰度都略多于其他组，在纲水平中革兰阴性杆菌丰度最低，γ-变形菌纲丰度高于其他组。各治疗组经给药治疗后，Alpha多样性Shannon和Simpson指数分析得知，模型组中菌群多样性显著低于空白组，黄芩汤高剂量组的菌群多样性最接近于空白组且较稳定。稀疏曲线表明测序深度足以研究每个样本的微生物多样性，距离矩阵与PCoA分析可知模型组的群落组成具有显著差异，黄芩汤高剂量组相对而言趋于空白组菌群群落。经差异菌分析可知模型组中拟杆菌属较多，各治疗组中乳杆菌属含量较多，阳性药物组中厚壁菌门丰度最多，模型组中罗氏弧菌、白粉菌科、梭菌属、粪球菌属、拟杆菌属、绿菌科与其他组存在差异，普雷沃氏菌属与科水平均在模型组中表达，阳性药物中假丁酸弧菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、梭菌科、消化链球菌科丰度表达较高，黄芩汤低剂量组丰度最多的是立克菌，黄芩汤中剂量组莫拉菌科和不动杆菌丰度表达较高。
结论：利用网络药理与生物信息学、分子生物学以及16s rDNA测序技术可证实黄芩汤可通过降低炎症因子IL6、IL1β，提高IL10继而影响肠道菌群多样性，使有益菌的丰度升高，有害菌丰度降低，从而参与抑制IL17、TNF等信号通路中IL6、IL1β蛋白因子的表达水平，达到发挥治疗溃疡性结肠炎的作用。
方法：利用TCMSP数据库筛选黄芩汤四味药材的有效成分和作用靶点，在GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库以及GEO数据库筛选疾病基因信息，对疾病与中药成分靶点绘制韦恩图并构建PPI网络，用R4.0.4软件和Cytoscape3.8.0软件中的CytoNCA和BisoGenet进行筛选和拓扑分析并构建网络，用R语言进行GO、KEGG富集分析及KEGG关系网络构建，最终得到黄芩汤治疗溃疡性结肠炎的主要有效成分、核心靶点以及代谢通路。采用葡聚糖硫酸钠构建溃疡性结肠炎小鼠模型并在行为学、体重变化、粪便隐血测试、疾病活动指数、结肠组织形态观察及结肠组织病理学检查等方面进行模型评价。模型建立后将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、黄芩汤高剂量组、黄芩汤中剂量组和黄芩汤低剂量组，给药治疗21d后收集各组小鼠结肠组织，观察结肠组织形态学病变情况，HE染色进行结肠组织病理学检查、免疫组化检测结肠组织中IL1β、IL6、IL10和TGFβ细胞因子含量变化，采用16s rDNA测序技术检测各组小鼠肠道菌群变化，以此来研究黄芩汤对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用、炎症因子的变化以及对肠道菌群的影响。
结果：网络药理学和生物信息学共同检索结果得到黄芩汤中165个有效成分，主要包括黄酮类、生物碱、萜类等，相关靶点有2836个，160个交集靶点，GEO数据库筛选得到910个差异基因，其中实验组上调基因575个，下调335个。经“有效成分-UC靶点”网络的构建获得连接疾病节点数目最多的成分为槲皮素、汉黄芩素、刺槐素、山奈酚、柚皮素，PPI网络构建得到IL6、IL1β、FOS、STAT3等关键因子，GO和KEGG富集分析及KEGG网络构建得知黄芩汤治疗溃疡性结肠炎主要在TNF和IL17等信号通路上富集，核心基因为IL6、IL1β、FOS、JUN等。经动物实验可知，黄芩汤可改善模型小鼠精神状态等行为学特征，降低粪便隐血测试阳性表达，提高小鼠体重。阳性药物组、黄芩汤治疗组结肠长度较模型组显著上升，黄芩汤中剂量组结肠组织颜色趋于正常，长度最接近空白组，HE染色可观察到黄芩汤中剂量组与阳性药和黄芩汤高剂量组比，炎性细胞明显减少，腺体排列较为规则，免疫组化得知空白组与模型组IL6、IL10有显著性差异（P＜0.01），IL1β有统计学意义，与空白组比较，模型组IL1β、IL6含量显著上升、IL10含量显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩汤高中低剂量组IL1β显著下降（P＜0.05）黄芩汤中剂量组IL1β含量最少，阳性药、黄芩汤中剂量组IL6显著下调（P＜0.01），阳性药、黄芩汤高、中剂量组IL10显著上调（P＜0.01），高剂量组含量最多，其次是低剂量组、高剂量组、阳性药物组；各组中TGFβ含量无显著性差异（P＞0.05）。通过16s rDNA技术测得2705010条肠道菌群序列，物种分类学显示模型组中拟杆菌门、变形菌门丰度都略多于其他组，在纲水平中革兰阴性杆菌丰度最低，γ-变形菌纲丰度高于其他组。各治疗组经给药治疗后，Alpha多样性Shannon和Simpson指数分析得知，模型组中菌群多样性显著低于空白组，黄芩汤高剂量组的菌群多样性最接近于空白组且较稳定。稀疏曲线表明测序深度足以研究每个样本的微生物多样性，距离矩阵与PCoA分析可知模型组的群落组成具有显著差异，黄芩汤高剂量组相对而言趋于空白组菌群群落。经差异菌分析可知模型组中拟杆菌属较多，各治疗组中乳杆菌属含量较多，阳性药物组中厚壁菌门丰度最多，模型组中罗氏弧菌、白粉菌科、梭菌属、粪球菌属、拟杆菌属、绿菌科与其他组存在差异，普雷沃氏菌属与科水平均在模型组中表达，阳性药物中假丁酸弧菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、梭菌科、消化链球菌科丰度表达较高，黄芩汤低剂量组丰度最多的是立克菌，黄芩汤中剂量组莫拉菌科和不动杆菌丰度表达较高。
结论：利用网络药理与生物信息学、分子生物学以及16s rDNA测序技术可证实黄芩汤可通过降低炎症因子IL6、IL1β，提高IL10继而影响肠道菌群多样性，使有益菌的丰度升高，有害菌丰度降低，从而参与抑制IL17、TNF等信号通路中IL6、IL1β蛋白因子的表达水平，达到发挥治疗溃疡性结肠炎的作用。