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目的:探讨以RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术靶向stathmin(STMN1)和mdr1基因逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药的可行性。
方法:
1.构建分别靶向stathmin和mdr1基因的小发卡(small hairpin RNA,shRNA)结构的重组质粒:pGU6-GFP-neo-STMN1和pGU6-GFP-neo-MDR1,并进行酶切和测序鉴定。
2.用脂质体Lipofectamine2000将质粒转染到人卵巢上皮癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测stathminm和mdr1基因的mRNA变化,Western-blot检测其蛋白表达变化。
3.将质粒单转染和共转染到SKOV3/TAX,Hoechst33342与PI双染后荧光显微镜检测细胞凋亡情况,CCK-8法分析细胞增殖情况和对紫杉醇的敏感性。
结果:
1.成功构建pGU6-GFP-neo-STMN1和pGU6-GFP-neo-MDR1质粒,酶切鉴定和测序提示质粒构建正确。
2.Real-time PCR及Western-blot显示紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX的stathmin和mdr1基因的mRNA和蛋白表达明显高于人卵巢上皮癌细胞SKOV3(P＜0.05)。SKOV3/TAX细胞转染后,pGU6-GFP-neo-MDR1质粒对mdr1基因,pGU6-GFP-STMN1质粒对stathmin基因在mRNA和蛋白水平均有明显抑制(P＜0.05),阴性对照组与SKOV3/TAX细胞组相比并无统计学意义。
3.各组细胞经Hoechst33342与PI双染后,荧光显微镜下可见对照组SKOV3/TAX细胞着色很浅;转染阴性质粒组变化不明显;转染pGU6-GFP-neo-MDR1质粒组和转染pGU6-GFP-neo-STMN1质粒组凋亡细胞增多;SKOV3/TAX细胞共转染组有较多明亮的蓝色荧光着色细胞核,染色质浓缩,还有凋亡小体,凋亡最明显。
4.CCK-8示单独转染pGU6-GFP-neo-MDR1质粒或pGU6-GFP-neo-STMN1质粒均能抑制肿瘤细胞增殖,逆转耐药,共转染组效果更好。
结论:
体外RNAi可有效沉默卵巢癌紫杉醇耐药株SKOV3/TAX细胞内stathmin和mdr1基因的表达,两个单靶点干扰均可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制增殖,逆转其紫杉醇耐药,双靶点联合干扰的效果更明显。从而为进一步的体内实验奠定基础,为多靶点基因治疗提供新思路。