单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究

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血栓性疾病是严重危害人类健康的常见多发病,心脑血管疾病中有很大比例本质为血栓病,它主要危害心、脑、肺等的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在我国,每年有超过260万人死于心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万人,并且,这类疾病的发病率曾逐年上升趋势。纤溶疗法是治疗血栓性疾病的主要手段之一,迄今溶栓药物已发展了三代,但距理想的溶栓药物尚有差距。寻找和开发新型溶栓剂仍是心脑血管疾病治疗的重要内容。鉴于海洋生物活性物质具有独特的优点,海洋生物日益成为新药开发的珍贵资源。本实验室经多年研究,从海洋无脊椎动物单环刺螠中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:单环刺螠纤溶酶在单环刺螠体腔液及内脏等组织内含量丰富,经优化工艺可提取多种酶活力组分,很可能是一组同工酶。我们试用两套工艺均能制得单环刺螠纤溶酶UFEⅠ,达电泳纯,经过提取分离纯化工艺的酶纯化倍数可达11-12倍,产品酶得率可达27.0-30.0%。单环刺螠纤溶酶经Native-PAGE电泳分析,该酶纯度已经达到99%;经SDS-PAGE和飞行质谱测定其分子量约为23,800Da;糖含量测定表明,该酶不是一种糖蛋白。单环刺螠纤溶酶,在45℃以下时酶活力稳定,6 h内酶的活性基本保持不变;在10种不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)的缓冲液中于室温下放置24 h,酶活无明显改变。单环刺螠纤溶酶的最适反应温度为45℃,最适pH约为6.5。Ag+离子对单环刺螠纤溶酶有抑制作用,Mn2+和Mg2+离子对酶有活化作用。其他金属离子。以酪蛋白为底物,根据双倒数作图法(Lineweaver-Burk plot)求出的酶反应的动力学常数为:Km=3.48×10-3mol·L-1,Vmax=1.20×10-2mol·L-1·min-1。单环刺螠纤溶酶对纤维蛋白具有很高的亲和性,不仅可以降解纤维蛋白,还具有较高的激酶活性,这使得该酶能够激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地溶解纤维蛋白。体外抗凝、溶栓实验结果表明:与蚓激酶相比,单环刺螠纤溶酶具有更好的抗凝作用和溶栓效果,而且对血红细胞损伤较小。综上所述,由于单环刺螠纤溶酶分子量小、酶活性稳定、溶栓活性强、对血红细胞损伤小等优点,做为溶栓剂具有潜在的应用开发价值。
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