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纤维性肌动蛋白(F-actin)与微管是神经元的主要细胞骨架,神经元死亡以二者进行性降解为主要特征,因此采用F-actin和微管稳定性药物来加固神经元细胞骨架,对于防治神经元迟发性死亡可能具有一定作用。我们前期实验结果显示,癫痫持续状态后,树突棘F-actin进行性减少,但是树突干及胞体内F-actin却出现聚集现象。由于树突棘基底部F-actin附着在树突干内的微管上,我们推测癫痫脑内F-actin聚集可能是由于树突干微管解聚后F-actin失去锚定和支撑作用所致,树突棘F-actin损伤直接引起神经元兴奋性异常,而树突干微管解聚则会加重树突棘F-actin的损伤。脑缺血与癫痫持续状态的病理过程相似,但是采用脑缺血模型研究海马神经元迟发性死亡的成功率较高,重复性较好。因此,本项目拟采用匹鲁卡品和四血管阻断法(4-VO)诱导的迟发性神经元死亡模型,进一步探讨神经元迟发性死亡后F-actin和微管的动力学变化及神经元迟发性死亡的进程,进而采用细胞骨架稳定性药物探讨细胞骨架药物对迟发性神经元死亡的影响,旨在阐明F-actin和微管在癫痫和脑缺血发展过程中与神经元死亡的关系,进而探讨同时增强两大细胞骨架对迟发性死亡的抑制效果。实验方法和结果具体如下一、通过稳固F-actin细胞骨架减缓迟发性神经元死亡的实验研究本实验采用匹鲁卡品诱导的迟发性神经元死亡模型,通过行为学观察小鼠发作时间和发作频率的变化;Nissl染色与Anti-Neu N染色检测神经元死亡情况,免疫荧光染色和phalloidin染色观察胶质细胞增生及F-actin变化情况;通过Western blot法检测F-actin及cofilin、p-cofilin蛋白表达情况。⑴行为学观察显示,采用FK506治疗后,小鼠自发发作频率和单次发作的持续时间均显著降低;⑵FK506部分抑制了海马CA1区和CA3区神经元的死亡,减少了胶质增生;此外,与模型组相比,治疗组F-actin阳性面积也有所增加;⑶Western blot结果表明,注射FK506后,海马CA1区F/G比值显著增加,cofilin磷酸化显著增高,说明FK506在一定程度上减少了F-actin的降解。上述结果提示,钙调磷酸酶抑制剂FK506在一定程度上能够缓解癫痫症状,但是对于F-actin的降解和神经元迟发性死亡的保护作用并不明显,所以我们推测还有其他原因与神经元迟发性死亡有关。二、体内体外迟发性神经元过程中F-actin和微管的改变本实验采用体内外迟发性神经元模型,通过Ni ssl染色、Fluoro-Jade B(F-JB)染色,以及透射电子显微镜检测迟发性神经元死亡情况,通过激光共聚焦显微镜观察F-actin和微管相关蛋白的变化,Western blot检测海马各区F/G比值、cofilin、p-cofi lin、drebrin A、β-tubulin III、M AP2以及acet yl-a-tubulin蛋白的表达情况,免疫共沉淀方法检测F-actin、G-actin与PSD95、cofilin、p-cofilin、drebrin A之间的相互作用。⑴4-VO诱导迟发神经元死亡后,海马CA1区锥体细胞在缺血第2d开始发生死亡,随着时间延长而变得严重,缺血再灌注7d神经元死亡达到最大。海马CA1区F-actin在缺血后第2d阳性面积开始减少,第7d时面积达到最低。缺血后树突棘内F-actin失去drebrin A的结合,导致F-actin稳定性下降。另一方面,cofilin活性显著增强,可能是F-actin发生解聚的直接原因。⑵与F-actin解聚相似,神经元微管蛋白β-tubulin III、MAP2和acty-tubulin在缺血后也发生进行性减少。但是共定位分析表明星形胶质细胞内微管成分却反而增多。Western blot结果显示,MAP2、β-tubulin III、acetly-α-tubulin的蛋白水平在短暂性缺血后显著降低。通过免疫共沉淀实验验证F-actin、G-actin与PSD95、cofilin、p-cofilin、drebrin A之间的相互作用。免疫沉降实验结果表明,在树突棘内与F-actin结合的drebrin A在缺血后第2d和7d显著降低,但是与F-actin结合的cofilin含量极低。⑶海马神经元原代培养条件下,OGD/R 1h和1.5h后神经元的阳性率明显升高,F-acin进行性降解和短暂性杆状聚集发生在DNA断裂之前。与此同时,drebrin A、cofilin以及p-cofilin的表达显著减少。另一方面,神经元微管也发生进行性减少,微管稳定性明显降低。以上结果提示,4-VO诱导迟发神经元死亡后海马神经元内F-actin发生进行降解,但是在树突干内出现短暂性聚集现象。另一方面,神经元微管也发生进行性减少,微管稳定性明显降低。三、通过稳固微管细胞骨架减缓迟发性神经元死亡的实验研究本实验采用4-VO诱导的迟发性神经元死亡模型,通过免疫荧光染色、Fluoro-Jade B和Nissl检测不同剂量Epo D对短暂性全脑缺血后海马CA1区微管损伤和迟发性神经元死亡的影响,在此基础上探讨采用细胞骨架稳定性药物治疗迟发性神经元死亡的可能性。⑴Fluoro-Jade B和Nissl结果显示:注射低剂量Epo D(0.5mg/kg)能够轻微抑制海马CA1区神经元的死亡;而使用高剂量Epo D(3mg/kg)治疗不能抑制神经元的死亡。⑵免疫荧光染色结果显示:注射低剂量Epo D(0.5mg/kg)能够轻微抑制微管及相关蛋白的减少,而高剂量Epo D(3mg/kg)对微管解聚没有治疗意义。在本研究中,大鼠给药前后的结果很相似,皆表明低剂量的Epo D仅略为降低缺血诱导的海马神经元死亡数量,而高剂量的Epo D会导致海马CA1区以外的区域发生额外的神经元死亡。由于海马CA1区神经元与齿状回颗粒细胞的微管组装特性差异较大,因此,破坏微管组装平衡的微管干扰药物可能会对不同种类的神经元产生复杂的影响。结论综上所述,通过匹鲁卡品和4-VO诱导迟发性神经元模型中,海马神经元树突棘F-actin均发生进行性降解,而树突干内F-actin出现短暂性聚集现象。类似的结果在体外神经元缺血实验中也得到了证实。另一方面,神经元内微管骨架也发生进行性降解,但是星型胶质细胞内微管成分却显著增高。神经元的结构高度依赖F-actin和微管,神经元迟发性死亡后这两种细胞骨架均发生解聚,暗示着细胞骨架稳定性药物很可能具有抑制神经元死亡的效果。我们发现,FK506在一定程度上减缓了F-actin解聚和神经死亡进程,同时动物行为也具有一定的改善。但是,Epo D低剂量和高剂量对神经元死亡却产生了相反的作用。大脑区域不同,神经元内细胞骨架的组装特性也不同。除了神经元亚型的差异之外,微管的装配特征在特定神经元的不同区域之间也存在很大的差异。因此,干扰微管组装平衡的微管干扰药物可能会对不同种类的神经元产生复杂的影响。通过上述实验,我们初步阐明了神经元迟发性死亡后F-actin和微管的变化规律,并初步探讨细胞骨架药物对迟发性神经元死亡的治疗效果,为揭示神经元迟发性死亡治疗提供了新的理论基础。