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背景和目的:EB病毒(EBV)是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员之一,在人群中广泛感染,与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来EB病毒相关胃癌作为一种独特的分子亚型疾病逐渐被人们所知。全球的胃癌患者之中平均有10%为EB病毒相关胃癌(EBV-associated gastric cancer,EBVa GC),但目前对其发病机制的研究尚不明确。AXL基因编码的蛋白是受体酪氨酸激酶亚家族中的一员。AXL基因作为原癌基因,可激活众多通路,其中AXL激活PI3K/AKT途径是其信号转导过程中的重要通路之一,该通路的激活在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。本研究旨在探讨EBVa GC中EBV对AXL基因表达的影响及调控AXL基因表达的相关机制,为进一步阐明EBVa GC的发病机制提供实验依据。方法:(1)利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)检测EBV阳性胃癌细胞系(GT38、GT39、SNU719)和EBV阴性胃癌细胞系(AGS、BGC823、SGC7901、HGC27)中AXL基因的转录表达情况。(2)Western-Blotting检测EBV阳性胃癌细胞系(GT38、GT39、SNU719)和EBV阴性胃癌细胞系(AGS、BGC823、SGC7901、HGC27)中AXL蛋白的表达情况。(3)免疫组化技术检测EBV阳性胃癌组织和EBV阴性胃癌组织中AXL蛋白的表达。(4)利用亚硫酸氢盐-基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing,BGS)检测EBV阳性胃癌细胞系(GT39、SNU719)和EBV阴性胃癌细胞系(BGC823、SGC7901、HGC27)中AXL基因启动子区域甲基化的状态。(5)采用质粒转染方法建立潜伏膜蛋白2A(LMP2A)过表达EBV阴性胃癌细胞系SGC7901细胞模型,检测LMP2A过表达对AXL基因表达的影响。(6)利用生物信息学方法筛选出可能靶向AXL基因的EBV编码micro RNA(mi RNA)。采用q RT-PCR技术检测EBV阳性胃癌细胞系(GT39、GT38、SNU719)和EBV阴性胃癌细胞系(BGC823、SGC7901、HGC27)中三种EBV编码mi R的表达水平。分别将人工合成的mi R-BART4-3p模拟物和mi R-BART4-3p抑制物及相应的阴性对照瞬时转染至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901和EBV阳性胃癌细胞系GT38中,利用q RT-PCR检测mi R-BART4-3p的表达水平,后利用Western-Blotting检测AXL基因的表达水平。同时利用CCK8细胞增殖与毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、细胞划痕及流式细胞术检测上述转染细胞及相应的对照组细胞的增殖、迁移和凋亡情况。结果:(1)qRT-PCR结果显示EBV阳性胃癌细胞系中AXL基因转录表达的水平均明显低于EBV阴性胃癌细胞系(P<0.05)。(2)Western-Blotting结果显示,AXL蛋白在EBV阳性胃癌细胞系中表达较EBV阴性胃癌细胞系低(P<0.05)。(3)免疫组化结果显示,EBVa GC和EBVn GC组织中AXL蛋白表达无明显差异(P>0.05)。(4)BGS结果显示阳性胃癌细胞系与EBV阴性胃癌细胞系中AXL基因启动子区域甲基化水平无明显差异(P>0.05)。(5)EBV阴性胃癌细胞系SGC7901过表达LMP2A后,AXL基因的转录及翻译水平均下降(P<0.05,P<0.05)。(6)利用生物信息学方法选出mi R-BART4-3p、mi R-BART19-5p、mi R-BART21-3p可能为靶向AXL基因的EBV编码mi RNA。q RT-PCR结果显示mi R-BART4-3p在三种EBV阳性胃癌细胞系中均高表达。EBV阳性胃癌细胞系GT38转染mi R-BART4-3p抑制物后mi R-BART4-3p的表达水平与其相应的阴性对照组相比无明显差异(P>0.05),EBV阴性胃癌细胞系SGC7901转染mi R-BART4-3p模拟物后mi R-BART4-3p的表达水平与其相应的阴性对照组相比明显增高(P<0.05)。EBV阳性胃癌细胞系GT38转染mi R-BART4-3p抑制物后,AXL蛋白的表达水平与其相应的阴性对照组相比明显增高(P<0.05),EBV阴性胃癌细胞系SGC7901转染mi R-BART4-3p模拟物后,AXL蛋白的表达水平与其相应的阴性对照组相比明显降低(P<0.05)。与其相应的阴性对照组相比,EBV阳性胃癌细胞系GT38转染mi R-BART4-3p抑制物后的细胞存活能力和迁移能力均明显增加(P<0.05,P<0.05),细胞凋亡比例明显降低(P<0.05);与其相应的阴性对照组相比,EBV阴性胃癌细胞系SGC7901转染mi R-BART4-3p模拟物后的细胞存活能力和迁移能力均明显降低(P<0.05,P<0.05),细胞凋亡比例明显增加(P<0.05)。结论:(1)与EBV阴性胃癌细胞系相比,EBV阳性胃癌细胞系中AXL基因的转录水平及翻译水平均较低,提示EBV可抑制AXL基因的表达。(2)EBV阳性胃癌组织中AXL蛋白的表达与EBV阴性胃癌组织相比没有明显的差异,提示AXL基因在EBV相关胃癌中的表达可能存在更复杂的调控机制。(3)EBV不诱发AXL基因启动子区域的甲基化状态发生改变,提示AXL基因的表达在EBV阳性胃癌细胞系中受抑制可能不是由启动子甲基化状态的改变所致。(4)LMP2A可抑制AXL基因的表达,提示LMP2A可能参与AXL基因表达的调控。(5)mi R-BART4-3p可抑制AXL基因的表达,且EBV阳性胃癌细胞系GT38中mi R-BART4-3p表达下调可促进细胞的增殖和迁移,抑制细胞的凋亡;而EBV阴性胃癌细胞系SCG7901中mi R-BART4-3p表达上调可抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。提示mi R-BART4-3p可能参与AXL基因表达的调控,并且EBV编码mi R-BART4-3p作为抑癌因子在EBVa GC的发生发展中可能发挥一定的作用。