背景:目前,肝癌是全球第二大与癌症相关的死亡原因,严重威胁人类的生命健康,亚洲地区的肝癌发病率和死亡率全球最高。肝癌是我国重要的公共卫生问题,肝细胞癌（HCC）约占肝癌的90%,与肝硬化、乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染关系最为密切。中医药治疗肝癌有着悠久的历史和丰富的经验,属于中医癥瘕积聚、肝积、胁痛、臌胀、黄疸等范畴,其病机主要为本虚标实,实者与气滞、血瘀、痰凝、毒聚有关;虚者与正气亏虚、肝肾阴虚等有关,中医药治疗肝癌方面有独特优势,关于其抗癌机制的研究日益增多。三棱加参方由经典抗癌方三棱丸加人参组成,是结合肝癌自身发病特点和中医攻补兼施、气血兼顾的治癌理念自主创新的治疗处方,临床中对肝细胞癌患者有确切疗效,现代药理研究也证实,三棱加参方中四味中药均有抗肿瘤活性。本课题在三棱加参方临床中确切抗癌效果的基础上,从细胞和动物水平系统研究了三棱加参方对肝细胞癌的干预作用,同时结合我国肝细胞癌患者大多是由慢性病毒性肝炎导致的发病现状,从炎症因子IL-6介导的JAK2/STAT3信号通路初步探讨三棱加参方抗肝细胞癌的可能作用机制。第一章:基于网络药理学预测三棱加参方干预肝细胞癌的可能作用机制目的:探讨三棱加参方干预肝细胞癌的可能作用机制,为后续实验提供依据。方法:利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）,筛选三棱加参方的核心成分、作用靶点;构建三棱加参方治疗肝细胞癌“成分-靶点-疾病”网络图;进行基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果:通过TCMSP数据库筛选得到三棱加参方潜在靶点103个,通过Genecards数据库筛选得到HCC的疾病靶点6363个,二者共同作用靶点80个;KGEE分析显示与炎症相关的通路有乙肝病毒感染（HBV）、丙肝病毒感染（HCV）、白介素17（IL-17）,疱疹病毒感染等;与代谢相关有脂质和粥样硬化、糖尿病并发症和AGE-RAGE信号通路,非酒精性脂肪肝等;与肿瘤相关通路有化学致癌-受体激活信号通路、小细胞肺癌、肿瘤坏死因子信号通路（TNF）、细胞凋亡（Apoptosis）、前列腺癌、P53信号通路等,其中与HBV差异最为显著,该通路包含了与肝癌发生发展最为密切的经典信号通路,即由IL-6介导的JAK2/STST3信号通路。结论:三棱加参方主要通过调节HBV信号、抑制炎症反应等途径发挥抗肝细胞癌的作用。第二章:三棱加参方抗肝细胞癌的作用及机制研究目的:探讨三棱加参方对人肝癌细胞及小鼠移植瘤模型的抑瘤作用。方法:1.CCK-8法观察三棱加参方对人肝癌细胞株Hep G2和HCCLM3细胞增殖的影响,以及对人肝细胞L02的细胞毒性;平板克隆形成实验、细胞计数法测定细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;Western blot检测细胞增殖、凋亡、迁移等相关蛋白的表达。2.Western blot检测JAK2/STAT3通路关键蛋白JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3等表达水平,其上游炎症因子IL-6表达水平以及其下游关键蛋白MMP2、MMP9表达水平,检测PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT等蛋白表达水平。3.建立小鼠皮下移植瘤模型,三棱加参方干预后测量瘤体积,免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞形态及增殖和凋亡标志物的表达,Western blot检测凋亡相关蛋白和JAK2/STAT3通路中蛋白表达情况。结果:1.CCK-8法检测发现三棱加参方以时间和剂量依赖的方式抑制人肝癌细胞增殖（P＜0.05）,对人肝细胞L02的细胞活力无明显影响;平板克隆形成实验和细胞计数实验表明,三棱加参方能抑制肝癌细胞的增殖能力。2.流式细胞术检测发现,三棱加参方能够诱导人肝癌细胞株Hep G2的发生周期阻滞,使细胞周期阻滞在G1期,同时三棱加参方能够诱导人肝癌细胞Hep G2、HCCLM3的发生凋亡,且随着剂量的增加,晚期凋亡数增加（P＜0.05）。3.Western blot检测发现,三棱加参方能抑制人肝癌细胞的增殖,对于增殖相关蛋白Ki67的表达水平有抑制作用;检测凋亡相关蛋白水平的变化发现凋亡相关蛋白BCL2水平降低,Caspase3、Cleaved Caspase3、BAX蛋白表达水平升高,诱导了人肝癌细胞发生凋亡;检测细胞周期相关蛋白水平发现,周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin B1,C-myc的表达水平下调。4.Western blot实验结果显示,三棱加参方除促进细胞凋亡,抑制增殖和诱导细胞周期阻滞外,炎症因子IL-6、AKT、P-AKT、NF-кB等表达水平出现下调,同时与HCC发生关系密切的JAK2/STAT3信号通路中的相关蛋白的表达水平均出现下调,其下游关键蛋白MMP2、MMP9表达水平下调。5.动物实验表明,三棱加参方治疗组的瘤体积和瘤重都较对照组减小,中、高剂量组与对照组比较,结果具有显著性差异;同时HE染色未发现小鼠脏器出现异常,免疫组织化学染色显示三棱加参方干预后增殖相关蛋白Ki67表达水平显著降低,凋亡蛋白BAX、Cleaved Caspase3的表达水平显著升高、BCL2表达水平降低;Western blot检测肿瘤组织中炎症因子表达水平,其中IL-6、NF-кB、AKT等表达水平均下调,JAK2、STAT3及其下游MMP2、MMP9等表达水平均受到抑制。结论:1.三棱加参方可抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞发生周期阻滞和凋亡。2.其机制可能通过抑制炎症反应,下调IL-6介导的JAK2/STAT信号通路,从而发挥抗肿瘤作用。第三章:三棱加参方活性成分之一人参皂苷Rg3对肝细胞癌的干预作用目的:三棱加参方活性成分人参皂苷Rg3对肝细胞癌的抗肿瘤作用及可能机制。方法:1.CCK-8法、平板克隆实验检测人参皂苷Rg3对人肝癌细胞Hep G2和HCCLM3增殖能力的影响;2.流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blot检测增殖、周期、凋亡、炎症等关键蛋白的变化水平;3.建立小鼠皮下移植瘤模型,经人参皂苷Rg3干预27天后观察体重、瘤体体积变化,Western blot、免疫组化检测增殖、凋亡相关蛋白的表达情况。结果:1.CCK-8法检测发现人参皂苷Rg3能够抑制人肝癌细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）,并且人参皂苷Rg3对人肝细胞L02的细胞活力无明显影响;克隆形成和细胞计数实验结果表明,人参皂苷Rg3能够抑制Hep G2、HCCLM3细胞的增殖能力（P＜0.01）。2.流式细胞术检测发现,人参皂苷Rg3能够诱导人Hep G2细胞发生周期阻滞,同时诱导人肝癌细胞发生凋亡（P＜0.05）。3.Western blot检测发现,在Hep G2、HCCLM3细胞中,对增殖相关蛋白Ki67的表达均有抑制作用;凋亡相关蛋白Bcl-2水平降低（P＜0.01）,Cleaved Caspase3、BAX蛋白表达水平升高（P＜0.01）;细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin B1,C-myc的表达水平下调。4.Western blot检测进一步发现IL-6、AKT、P-AKT、NF-кB等表达水平均出现下调（P＜0.01）,同时与HCC发生关系密切的JAK2/STAT3信号通路中的相关蛋白的表达水平均出现下调,其下游关键蛋白MMP2、MMP9表达水平下调（P＜0.01）。5.动物实验表明,人参皂苷Rg3组的瘤体积和瘤重都较阴性对照组明显缩小（P＜0.05）;免疫组织化学染色显示增殖相关蛋白Ki67表达水平显著降低,凋亡蛋白BAX、Cleaved Caspase3的表达水平显著升高、BCL2表达水平降低;Western blot结果显示肿瘤组织中IL-6、NF-кB、AKT表达水平均下调,JAK2、STAT3,及其下游MMP2、MMP9等表达水平均受到抑制。结论:人参皂苷Rg3在体内外均有良好的抗癌效果,能抑制人肝癌细胞增殖,诱导肝癌细胞发生周期阻滞和凋亡,并且对JAK2/STAT3信号通路有调节作用。第四章:三棱加参方中活性成分人参皂苷Rg3和大黄素Emodin联用对肝细胞癌的作用及机制研究目的:三棱加参方活性成分Rg3和Emodin联用对肝细胞癌的影响。方法:1.CCK-8法、细胞计数法检测人参皂苷和大黄素联用对人肝癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测联合用药后对细胞周期和凋亡的影响,Western blot检测联合用药后对细胞增殖、凋亡等相关蛋白水平变化。2.建立小鼠人源肝癌移植瘤模型,联合用药干预25天后观察瘤体体积,免疫组化检测增殖、凋亡相关蛋白的表达情况。结果:1.CCK-8法检测发现大黄素对人肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3的增殖有较为明显的抑制作用,并呈时间和剂量依赖性,联合用药后,相比对照组和单加组,在两个细胞系中均表现为较强的抑癌效果,Hep G2和HCCLM3的细胞活力显著降低（P＜0.001）。2.细胞计数法结果示:联合用药处理24、48、72和96h后,两个细胞系其细胞活力显著抑制,相比Control对照组和单加药对照组,差异均具有统计学意义（P＜0.001）。3.Western blot发现干预48h后,联合用药组细胞增殖蛋白Ki67表达水平显著下降（P＜0.001）;BAX、Cleaved Caspase3、Caspase3表达水平显著上调（P＜0.001）;相比Rg3组和Emodin组,联合用药组Cleaved Caspase3、Caspase3的表达水平均显著上调,且差异具有统计学意义（P＜0.01）;此外相比单加组,联合用药组NF-кB和AKT、P-AKT、IL-6的表达水平均显著下调,且差异具有统计学意义（P＜0.01）。4.流式细胞术结果示,相比单加组,联合用药后细胞凋亡数目显著增加,差异具有统计学意义（P＜0.01）。动物实验表明联合用药后瘤体显著缩小（P＜0.01）,免疫组织化学染色显示联合用药后Ki67表达水平显著降低,凋亡蛋白BAX、Cleaved Caspase3的表达水平显著升高、BCL2表达水平降低,联合用药后抑瘤作用显著增强。结论:1.人参皂苷Rg3和大黄素Emodin联合用药后可显著抑制肝癌细胞增殖,诱导其凋亡,抑制炎症因子IL-6、NF-кB等表达水平。2.相比单加药组,联合用药后显著增强了人参皂苷Rg3和大黄素Emodin各自的抗癌效应。